脑干热休克蛋白70的表达与实验性脑损伤猝死的相关性.doc

脑干热休克蛋白70的表达与实验性脑损伤猝死的相关性 摘要：目的了解脑损伤后热休克蛋白70 (Heat-shock protein 70, HSP70) 蛋白质及mRNA在脑干局部的改变，及其对维持脑干生命中枢功能的作用。方法用头颅打击器制成大鼠脑损伤猝死模型，免疫组化法分别测定损伤组损伤前和损伤后1、3、6、12 h及损伤猝死组脑干HSP70的数量和分布变化；逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测各组相应部位HSP70 mRNA水平。 结果在脑损伤15 min后脑干HSP70 mRNA水平显著升高， HSP70蛋白质需36 h才大量表达；损伤后猝死的鼠脑中仅见HSP70 mRNA升高，HSP70蛋白质与对照组无差异。结论脑损伤后HSP70合成迅速增加，清除损伤因素，维持自稳状态；当损伤严重时，应激蛋白质的合成障碍，抗损伤的保护机制不能发挥，脑干生命中枢的功能紊乱，生命丧失。因此， HSP70 mRNA-蛋白质分离可作为神经细胞致死性损伤的标志。关键词： 热休克蛋白类； 脑损伤； 免疫组织化学； 多聚酶链式反应相关帮助需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网biomean进行咨询，期待您的加入脑损伤致死的机制涉及脑外伤危重程度的判定、抢救措施的实施及法医鉴定等。一般认为脑死亡的原因是位于脑干的生命中枢的生理活动停止。因脑干体积较小，损伤多不易发现，故何种程度的损伤为致死性损伤无确切标准。热休克蛋白(Heat-shock proteins, HSPs)作为应激反应的重要物质基础和标志，脑损伤后其表达增强已有报道13。作者发现脑干针刺损伤后，局部神经元中HSP70表达增强对于脑干开放性机械损伤具有定位价值。闭合性脑损伤时HSP70在脑干表达又如何，与生存是否相关？本研究通过观察脑损伤后大鼠脑干HSP70的表达与预后的关系，探讨致死性脑损伤的机制。1材料与方法1.1实验动物健康Wistar大鼠45 只，体质量180250 g，雌雄不拘。1.2试剂鼠抗鼠骨髓瘤 HSP70 抗体(Santa Cruz 公司)、HIGH-SABC免疫组化染色试剂盒 (武汉博士德公司)、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)、RNAgents Total RNA Isolation System(Promiga公司)、OligoDT (15)(Promiga公司)、逆转录酶M-MuLv Reverse Transcriptase(New England公司)、Taq酶(基因公司)PhIX174 DNA /Hea Markers(Promiga公司)。参考文献56，根据引物设计原则，确定HSP70、-actin PCR扩增引物：5-CTCGTGCGTGGCCGTGTTCC-3，5-TCGCCCTTGTAGTTCACCTG-3 (285 b p)； 5-ACTCCTACGTGGGCGACGAG-3，5-AGGTCCAGACGCAGGATGGC-3(388 bp)(Sangon公司)。1.3实验方法1.3.1动物模型 大鼠吸入乙醚麻醉，剪去枕部的毛，伏卧固定在自制的大鼠颅脑弹射打击装置上，打击锤与枕骨结节相对。拉动手柄，压缩弹簧，使击锤回退，读取击杆上弹簧压缩的距离(X)，松开手柄，击锤借弹簧推动打在枕骨结节上。该处颅骨较厚，承受打击时不易骨折，且下方是小脑延髓，易造成延髓桥脑损伤。根据虎克定律计算出鼠脑受到的打击力。将大鼠分3组：第1组为正常对照组(5只)，大鼠麻醉后直接处死；第2组为损伤组(56只)，打击时弹簧的X为58 cm，打击力1.022.61 kN；第3组为损伤猝死组(10 只)，X为912 cm，打击力3.315.88 kN。1.3.2取材打击后按预定时间剪大鼠心脏处死，取脑。福尔马林固定延髓，石蜡包埋，其余脑干称重。采用Promiga公司的RNAgents Total RNA Isolation System抽提总RNA。1.3.3HE及HIGH-SABC免疫组化染色取延髓冠状面切出5 m的组织切片。常规HE染色，免疫组化染色按试剂盒内说明书进行。400倍光镜下计数cv、 cd HSP70免疫活性阳性神经元、神经胶质细胞及血管内皮细胞的数量(每一处按上下左右及中央选择5 个视野)。1.3.4RT-PCR 随机引物OligoDT (15)逆转录鼠脑cDNA全序列，再用特异引物(HSP70、-actin)复合扩增。退火温度为61 ，循环30次。扩增产物经8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，银染，干胶，Marker为PhIX174 DNA/Hea 。电泳结果用扫描仪输入计算机，经Image Master VDS (3.0) 图像分析软件包处理，测出每条带的D()值，以同一样本的HSP70与内对照-actin的积分值的百分比值作为计量HSP70 mRNA的标准。所有数据用SPSS 8.0统计软件包处理。2结果2.1大体标本及HE染色损伤组大鼠打击后一般昏迷35 min，其中20只醒后出现不同程度的神经体征。分别于打击后15、30 min 和1、3、6、12 h取脑，镜下见13只大鼠蛛网膜下腔出血，脑实质小灶出血，损伤超过6 h者见脑水肿。损伤猝死组中8 只深昏迷，出现呼吸暂停，抽搐、角弓反张，昏迷815 min后相继死亡。其中2 只蛛网膜下腔出血严重，镜下见大脑顶枕叶有明显的脑挫伤、出血；其余6 只虽也有少量的蛛网膜下腔出血，但脑实质未见明显的挫伤、出血，HE示延髓微血管充血，神经元肿胀。2.2损伤前后脑干中HSP70蛋白质的表达免疫组化示HSP70蛋白质出现在神经元、血管内皮及神经胶质细胞的胞浆、生物膜。鼠脑机械损伤后短期内，延髓的HSP70阳性神经胶质细胞数量显著增加(F =4.285, P0.001)；血管内皮细胞的数量也迅速增加(F =5.735, P0.01)。延髓神经元中HSP70免疫阳性增强，最早出现在伤后1 h (t=2.133, P0.05) (图1，见封三)，并持续到伤后12 h。而严重损伤后猝死鼠脑脑干中HSP70阳性细胞种类和数量均无明显改变(表1)。 图1脑损伤后大鼠延髓神经元中HSP70蛋白表达增强(HE 染色，200)Fig.1Enhanced HSP70 expression in the neurons of the bulbus medulla after injury(HE staining,200)2.3损伤前后脑干中HSP70 mRNA的变化正常脑干HSP70 mRNA水平为(7.050.41)。脑损伤后(15 min、30 min、1 h、3 h、6 h)HSP70 mRNA 大量增加，15 min脑干内的HSP70 mRNA水平比对照组上升数倍(t=12.428, P0.001)(图2)，且重伤猝死大鼠脑干中HSP70 mRNA水平亦明显增高(t=5.381, P0.01)，但未达到损伤组的峰值(t=5.530, P0.001)，伤后6 h损伤组 HSP70 mRNA仍维持较高水平(表2)。脑干损伤后HSP70 mRNA表达迅速增强，说明局部增加的HSP70 蛋白质为内源性的，且HSP70 mRNA对应激损伤的反应明显比蛋白质迅速。 图2脑损伤后大鼠脑干中HSP70 mRNA含量Fig.2The levels of HSP70 mRNA in the brain stem after injury3讨论应激反应是生物体对趋于打乱其自稳状态的各种不良刺激的生物反应的总和，此代偿反应不足或不适当，就会造成生物稳态的破坏。而HSPs贴切地说应称(热)应激蛋白(heat) stress proteins，是生物体在高温及其它应激条件下合成的一组蛋白质，它们能增加生物体对各种损伤因子的耐受性，对生物体在严酷环境下生存起重要作用。在应激反应中，HSPs充当信息传递的介质和对抗损伤的保护因子。颅脑损伤时诱导HSPs表达增强的因素包括：(1)物理因素，如挤压、牵拉、切割造成的组织细胞损伤；(2)化学因素， 如缺氧、电解质紊乱、兴奋性物质，最重要的是各种蛋白质的异常，包括变性、聚积、错装、错叠、未折叠和蛋白质在细胞内外的异常转移；(3)血管因素，如血管痉挛导致栓塞、缺血、脑水肿、出血及血肿形成压迫等。最早发现HSP70在脑损伤后表达增强的是Brown， 随后不同的作者也先后证实不同类型脑损伤后，损伤局灶边缘及一些对损伤敏感的结构如海马CA1-CA3等处HSP70会明显增加。HSP70表达增强与损伤程度相关，一般出现在损伤后324 h。那么，升高的HSP70是否是损伤局部神经细胞对损伤因素的自身反应呢？动物实验表明脑损伤后HSP70基因的转录迅速增强，短时间内HSP70 mRNA水平上升数倍到十几倍。表明神经细胞在应激因素作用下，HSP70基因的转录被启动，HSP70大量表达。本研究侧重于脑外伤时脑干的损伤，结果发现一定程度的闭合颅脑损伤，即使大体及组织病理学检查未发现脑干明显异常，脑干延髓的HSP70 mRNA及蛋白质水平也明显升高，且表达增强的规律与开放性脑干损伤的基本相似。说明闭合性脑外伤时，各种损害因素同样也会作用于脑干，而HSP70对受损神经细胞的保护作用可维持神经细胞的基本功能，对脑干延髓生命中枢而言，表现为生命活动得以维持。损伤后猝死的大鼠脑干中，HSP70 mRNA短时内也明显升高，HSP70蛋白却未见相应升高。作者推测神经细胞此刻也作出