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机械性鼠脑皮层下横切后皮层神经元凋亡 作者：高李贵，王卉芳，刘重霄，师蔚 【关键词】 脑损伤 【Abstract】 AIM: To investigate the characteristics of cell apoptosis in cortex after mechanical white matter injury. METHODS: Twentysix SD rats suffering mechanical subcortical transection were killed at different time points postinjury, and the brains were obtained. The change of cells in lesion area and cortex was observed by HE staining, bufferedmethylen blue staining and TUNEL in situ endlabeling. RESULTS: Histopathological examination showed neuronal necrosis and glial cell proliferation in lesion site, while many neurons withered in the layer - of the corresponding cortex . Apoptotic neurons could be detected in the corresponding cortex as early as the 12th h postinjury. The number increased with time, peaked during 5th-7th d, and then declined. In the 19th d, the apoptotic neurons still could be detected in the corresponding cortex, while few apoptotic neurons were found in lesion area, and the time was presented in a singlewavecurve. CONCLUSION: The main pathological change of cortical neurons is not necrosis, but apoptosis after mechanical white matter injury. The apoptotic neurons are anatomically located in the corresponding cortical layer -. 【Keywords】 brain injury; subcortical transection; apoptosis 【摘要】 目的：探讨在机械性脑白质损伤后皮层神经元凋亡及其分布特征. 方法：制作大脑皮层下横切动物模型，于致伤后不同时间处死动物，用TUNEL原位末端标记和病理组织学方法观察损伤区及相应皮层神经元变化规律. 结果：致伤后，损伤部神经元出现坏死，胶质细胞增多，大脑V层神经元多出现萎缩. 伤后12 h，相应皮层内即出现散在凋亡神经元，后渐增多，7 d后又趋减少，伤后19 d皮层内仍可检出凋亡神经元，而在损伤区凋亡神经元少见，其时间分布呈一单峰状曲线. 结论：脑白质损害时，损伤相应部位皮层神经元主要表现为凋亡，分布于第V层. 【关键词】 脑损伤；皮层下横切；细胞凋亡 0引言 细胞凋亡与神经退行性疾病，缺血性脑损伤以及HIV脑病等多种神经系统疾病密切相关1,2. 在体研究表明，在颅脑外伤、缺血缺氧性脑损伤以及周围神经轴突切断时均存在中枢神经元凋亡3. 那么，在脑白质损害时大脑皮层神经元是否亦存在凋亡现象？其时间和空间分布特征如何？目前尚未见报道. 我们研究脑白质损伤过程中，相应大脑皮层神经元病理变化规律，从而为临床上脑白质性神经功能障碍的治疗提供新的思路. 1材料和方法 1.1材料 皮层下横切刀仿Dale法制作4，将刀片长度改为3 mm. 选用体质量240210 g的健康雄性SD大鼠26只，随机分为假手术组（12只）和模型组（14只）. 参照Dale法将耳棒固定于SD大鼠耳前1.0 mm，以电动小磨钻开颅，使横切刀与中矢面呈15夹角，刀片置于大脑皮层上，尖朝后. 假手术组至此提出横切刀. 模型组定位刀片根部坐标：前囟部中线旁1.0 mm，刀片降至皮层下1.4 mm，顺时针旋转180，再返回原位,完成大脑皮层下横切. 1.2方法 两组分别于致伤后0.25, 0.5, 1, 3, 5, 7, l0, 14和19 d全身灌注处死动物并取脑. 40 g/L甲醛固定48 h，冠状面切取经损伤区中央的切片3张, 厚5 m, 石蜡包埋. 分别行HE染色，亚甲蓝法尼氏染色和TUNEL法原位末端标记检测. 两组分别取上述各时点损伤区中央切片1张，行TUNEL法凋亡细胞检测（试剂来源 TdT：Promega公司; DigdUTP：B.M公司; antiDigbiotin：Sigma公司; SABC：Boster公司）. TUNEL反应液中不加TdT酶作为对照试验. 结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞. 观察损伤区相应部位大脑皮层内凋亡细胞的分布及类型，在40目镜下随机观察V层5个视野，计数阳性细胞数，结果取5个视野之和. 2结果 2.1病理组织学假手术组术后各时点尼氏及HE染色可见大脑皮层完整，各层结构清晰可辨且完好. 模型组损伤处及邻近组织内神经元肿胀，尼氏体溶解，核偏位或溶解，胞体出现破裂、溶解等坏死改变，胶质细胞增多. 大脑皮层V层细胞神经元多出现萎缩改变，核偏位或深染浓集. 术后19 d，损伤处几乎无结构正常神经元，代之以胶质细胞增生修复. 皮层内神经元数量减少，皮层不同程度萎缩. 2.2细胞凋亡检测假手术组神经元核大，呈多角形或圆形，核仁呈浅蓝色. 胶质细胞核小，呈圆或卵圆形，核仁不显示. 正常大脑皮层内凋亡细胞罕见（Fig 1A）. 模型组术后6 h未见凋亡细胞. 术后12 h损伤相应大脑皮层内出现散在早期凋亡神经元（Fig 1B）. 术后13 d损伤对应的大脑皮层内凋亡神经元明显增多，胶质细胞凋亡罕见. 术后5 d皮层内凋亡神经元继续增加，主要位于V层内，胶质细胞凋亡仍少见. 同时发现对侧相应部位大脑皮层内亦出现散在凋亡神经元. 术后7 d大脑皮层IIV层内出现大量凋亡神经元（Fig 1C），第VI层浅部神经元凋亡与坏死共存，而邻近损伤处的VI层深部神经元绝大多数为坏死，部分胶质细胞凋亡. 术后10 d大脑皮层内凋亡神经元有所减少，新旧凋亡细胞并存，可见凋亡小体，周围无炎症反应（Fig 1D）. 术后14，19 d皮层内凋亡神经元明显减少，至19 d时约1015个高倍视野，存活神经元数量较对侧明显减少，皮层不同程度萎缩. 3讨论 探讨脑白质损害时,其相应部位皮层神经元的病变规律,可为临床上该类病损的治疗提供新的理论依据. 我们研究发现皮层下脑白质损害时，损伤相应部位皮层神经元主要表现为凋亡，凋亡神经元主要分布于皮层V层，相邻皮层内亦有少量散在的凋亡神经元，且距离损伤处愈远凋亡愈少，考虑这与轴突切断后皮层神经元由于失去逆行运输的神经营养支持和信号传导有关，此与周围神经切断后其相应中枢神经元发生凋亡的报道相互支持3,5. 至于损伤对侧相应部位皮层内也有部分神经元发生凋亡的现象，推测可能是由于损伤累及胼胝体浅部至对侧大脑皮层的联系纤维所致. 本研究显示脑白质机械性损伤后，同侧相应大脑皮层内出现的凋亡神经元逐渐增多，于57 d达高峰，至少持续19 d，呈“少多少”的单峰曲线变化. 尽管在整体动物不同性质的脑损伤实验中，凋亡细胞的出现和时间变化规律有所不同，但其总的规律亦均为“少多少”单峰变化2,6，与本研究相一致. 此外，另有研究显示，在冲击所致的实验性脑和脊髓损伤时有大量胶质细胞凋亡7，与本研究结论相反，考虑这与此两类模型的致伤机制不同有关，需进一步研究. 【参考文献】 1Ekshyyan O, Aw TY. Apoptosis in acute and chronic neurological disordersJ. Front Biosci, 2004; 9(5):1567-1576. 2Martin LJ, Price AC, McClendon KB, et al. Early events of target deprivation/axotomyinduced neuronal apoptosis in vivo: Oxidative stress, DNA damage, p53 phosphorylation and subcellular redistribution of death proteinsJ. J Neurochem, 2003; 85(1): 234-247. 3Hausmann R, Biermann T, Wiest I, et al. Neuronal apoptosis following human brain injuryJ. Int Legal Med, 2003;118(1): 32-36. 4Dale SM，Kuang RZ，Wei X. Corticospinal motor neurons in the adult rat: Degeneration after intracortical axotomy and protection by the ciliary neurotrophic factor (CNTF) J. Exp Neurol, 1995; 135(1):67-73. 5Gupta R, Steward O. Chronic nerve compression induces concurrent apoptosis and proliferation of Schwann cellsJ. J Comp Neurol, 2003; 461(2): 174-186. 6Hobom M, Storch MK, Weissert R, et al. Mechanisms and time course of neuronal degeneratin in experime