紫外分光光度计测蛋白、核酸及使用方法.ppt

紫外分光光度法测定蛋白质含量,1、实验目的 （1）学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理； （2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术； （3）掌握紫外分光光度计的的使用方法。,2、实验原理 蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度呈正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。由于核酸在280nm波长也有光吸收，对蛋白质测量有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm。如同时测定260nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm的吸光度，才能通过计算测定溶液中的蛋白质浓度。,3、仪器与试剂 紫外可见光分光光计。 未知蛋白质标准溶液，可用结晶牛血清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成12.5mg/mL 的溶液。 0.9%NaCl溶液。,4、实验步骤 在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测得280nm和260nm两种波长的吸光度（A280和A260）。将A280及A260波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质弄高度 C=1.45A280-0.74A260 式中，C为蛋白质质量浓度（mg/ml）； 本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定往往较困难。,5、实验记录及数据处理 测定未知浓度蛋白质溶液的浓度,6、实验注意事项 （1）石英比色皿比较贵重，且易碎，使用时要小心。 （2）测量吸光度时，比色皿要保持洁净，切勿用手玷污其光面。,紫外分光光度计测定核酸含量,目的和要求 1、学习紫外吸收法测定核酸含量的原理。 2、掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法,实验原理 DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处。紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的性质。 用1cm光径的比色杯测定核酸的A260nm时，1ug/ml的DNA溶液吸光度为0.020，同样浓度的RNA吸光度为0.024.因此，可以用下列公式计算样品的核酸含量 DNA浓度（ug/ml)=A 260/0.02 RNA浓度（ug/ml)=A 260/0.024,实验器材 紫外分光光度计 实验材料及试剂 RNA或DNA样品,实验步骤 将样品配置成每毫升含550g的核酸溶液，于紫外分光光度计上测定260nm处的吸光度，按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值： DNA浓度（ug/ml)=A 260/0.02 RNA浓度（ug/ml)=A 260/0.024,实验记录及数据处理 测定未知浓度RNA溶液的浓度,紫外分光光度计使用方法,认识 紫外分光光度计,认识 紫外分光光度计,认识 紫外分光光度计,紫外分光光度计使用方法,开机自检，预热,紫外分光光度计使用方法,将对照及样品依次放入比色池中 选择“光度测量”模式,紫外分光光度计使用方法,输入测量所需的波长,紫外分光光度计使用方法,比色池推到对照组对准光源， 调100%透过率,紫外分光光度计使用方法,比色池拉到样品组对准光源， 测试。测量结果依次