综合性试验蛋白质的分离提取SDS.ppt

蛋白电泳及印迹技术（一） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,一、目的与要求 1.学习电泳原理和技术； 2.学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术；,1.电泳的基本原理,带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极移动，这种现象称为电泳。 生物分子所带电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。 混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量和形状的不同，在相同电场力的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，可达到分离鉴定各组分的目的。,二 、实验原理,2. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 阴离子去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）可与蛋白质相互作用，破坏蛋白质分子的非共价键，使蛋白质变性，失去原有的空间构象，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，使各种蛋白质分子间原有的电荷差异被消除或大大降低，仅保留了分子大小的差异。 蛋白质分子在电场中的迁移速度仅仅取决于各自分子的大小。当与标准分子量的蛋白质相比较，可以得出各蛋白质分子的分子量大小。,3.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要丙烯酰胺纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度高，可达10-6g； (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,4.凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关 分离蛋白质或核酸的分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6,5. 聚丙烯凝胶电泳的种类 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。,图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3,图1,图2 夹心垂直板电泳槽及凝胶模示意图,返回,图2,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续体系 由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是由AP（过硫酸铵）催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。 电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。,（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； （c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 (3)电荷效应,A. 样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 凝胶孔径的不连续性 缓冲液成分及pH的不连续性 电位梯度的不连续性,B.电荷效应,蛋白质样品进入分离胶后pH增大(pH 8.9)，Gly解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。,C.分子筛效应,分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。 分子量小，形状为球形的泳动速度最快。,三 操作步骤 贮液及凝胶溶液的配制 贮液及凝胶溶液的配制方法如下表。,贮液及凝胶溶液的配制,（二）样品制备 将蛋白质定量后溶解在含10g/L SDS、10g/L巯基乙醇的0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液中，100加热25min。蛋白质的最后浓度一般为0.051g/L。 也可以将上述溶液在37保温2h而不是100加热。一般说来，两种处理的效果都一样。但如蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37处理就会引起样品水解，使测定失败，而100加热3min一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况，需要采用特殊的样品处理方法。,（三）电泳 1.制备凝胶板 （1）洗净玻璃板，将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 （2）将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。 （3）用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约34 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。,（4）倒去分离胶面的蒸馏水，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板。 （5）静置10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，制胶完成。安装模具后入电泳装置，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。,2. 加样 用电泳缓冲液冲洗加样孔，用微量注射器按顺序向凝胶板中加样，每孔加一种样品，各加20l（含蛋白质10g），同时加入标准蛋白质marker。多余的加样孔用等量的1X上样缓冲液补足。 3. 电泳 加样完毕，正确连接电泳槽及电泳仪, 打开直流稳压电源（负极接上槽，正级接下槽，事先接好），将电流调至每管8mA。保持电流强度不变，待溴酚蓝染料迁移至距下口约1cm处，停止电泳。约需1.52.0h。,4 .染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记； 加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。,剥胶,四. 结果与计算 量出加样端距电泳前沿即溴酚蓝区带中心的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下列公式计算相对迁移率mR: 相对迁移率mR=,单选题： 1. SDS-PAGE电泳分离蛋白质中SDS是降低了下列哪个效应： （A）电荷效应（B）分子筛效应（C）浓缩效应 答案 A 2. SDS-PAGE电泳在浓缩胶阶段，缓冲体系中各离子泳动速度关系下列哪个是正确的？ （A）clprotein Gly （B） Gly cl protein (C) cl Gly protein (D) protein Gly cl 答案 A 3. SDS-PAGE电泳不可用于下列哪项？