实验八DNA重组子的构建与鉴定.ppt

实验八 DNA重组子的构建与鉴定,获得目的基因片段，选择好适当的载体， 并确定重组方案后，接下来要进行的就是片段之间的体外连接了（即DNA重组），从而获得DNA重组体又叫DNA重组子。 DNA重组子需转移入相应的受体细胞中用于对目的基因的扩增及目的基因的蛋白表达。,原理,DNA重组技术的操作过程,T-A cloning,MCS,重组体导入受体细胞可能的情况,由于重组体DNA分子导入受体细胞的比例通常较低，只有极少数受体细胞接受到重组体DNA分子，能实现目的基因的转移；绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的转化子。所以必须从大量的培养细胞中初步筛选出含有目的基因重组体的受体细胞并作进一步的鉴定。,重组体导入受体细胞的效率较低,重组体导入受体细胞后的筛选培养,常用鉴定方法,小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析 互补 杂交筛选,酶切和电泳方法,琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：,32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法,DNA杂交直接鉴定,Ampr抗性筛选和互补(蓝白斑)筛选,本实验所使用的载体质粒DNA为pUCm-T载体，由于其上带有Ampr 和lacZ基因，故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与-互补现象筛选相结合的方法。,Ampr抗性筛选,因pUCm-T载体带有Ampr基因，而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pUCm-T的受体菌（转化子）才能在含有Amp的LB平板上存活；只带有自身环化外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。,-互补,-互补的插入失活,pUC载体上LacZ基因的5端有一段多克 隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ （ -片段）的合成，但插入外源目的基 因后就会阻止LacZ的合成，使不能互补,蓝白斑筛选示意图,互补(蓝白斑)筛选,pUCm-T上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），但并没有破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能。E. coli DH5菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pUCm-T和DH5编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pUCm-T重组子和DH5融为一体时形成具有酶活性的蛋白质。,这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。 由-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。 当外源片段插入到pUCm-T质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变， 表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。此为-互补现象筛选。,实验材料试剂,外源DNA片段: 带A粘性末端的purified PCR product T-载体DNA: pUCm-T质粒(Ampr ，lacZ) T 4 DNA ligase, 5U/ul T4 DNA ligase buffer Sterilized ddH2O 宿主菌: 具有-互补能力的E. coli DH5菌株 Amp/X-gal LB plate,操作步骤,T-vector + PCR product Ligation 1.取新的0.5ml eppendorf管，编号。 2.依次加入： ddH2O 2l T-vector 1 l PCR product 5l 10T4 DNA ligase buffer 1l T4 DNA ligase 1l 3.混匀后将液体全部甩到管底, at RT for 0.5h,转化、涂板及培养,取5l连接产物 加入置于冰上的100l感受态 细菌（在1.5 ml管）中 置冰上30分钟 42oC热休克90秒 置冰上2分钟 加入0.5ml LB液体 在37oC 于120rpm复苏40分钟 5000rpm离心2分钟