《植物DNA的提取》PPT课件.ppt

植物DNA的提取,基本原理,DNA提取,DNA纯化,操作步骤,注意事项,核酸的分类及存在,脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA),与蛋白质结合在一起以 核蛋白（DNP）的形式存在。 在制备核酸时通常 破坏细胞壁及细胞膜来使 核蛋白释放出来。,核酸的理化性质,DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一 般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶 剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。 在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。,由于生物材料的差异，不可能有一种普遍适用的提纯生物体DNA的方法，植物材料有坚固的细胞壁，核酸含量较少，含有较多的多糖物质和色素、核酸酶活性高等这些因素给植物DNA的分离纯化带来了困难。,DNA提取,SDS法 SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸-蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。SDS是有效的阴离子去垢剂，细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。,十二烷基硫酸钠,CTAB法：,CTAB：十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。它能与核酸形成复合物。 在高盐溶液中(0.7molL NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3molL NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇随之被除去。,与SDS法相比,CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用。 该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的DNA及RNA，如果后继实验对二者都需要，则可分别进行纯化，如只需要DNA则可用RNase水解掉RNA。,CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离。 Tris-HCl (pH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。 NaCl 提供一个高盐环境，使CTAB与核酸形成的复合物充分溶解，存在于液相中。 EDTA(乙二胺四乙酸)螯合Mg2+ 或Mn2+ ，抑制DNase活性。 - 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，PVP-K30（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化，使酚容易去除。,CTAB提取缓冲液中各试剂的作用：,注意,- 巯基乙醇有很高的毒性，吸入 、摄入或经皮肤吸收后会中毒。 中毒表现有呕吐、震颤、头痛、昏迷，甚至死亡。对眼、皮肤有强烈刺激性。可引起角膜混浊。,DNA纯化（去杂质）,蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇。 多糖 提取液中加PVP。,聚乙烯吡咯烷酮, 是一种非离子型高分子化合物,操作步骤,1.称取 200-300mg 叶片装入 1.5ml 离心管，置于液氮中，用研磨棒研磨至粉碎，然后向离心管中加入 1000l 经过 65预热、含有 2%PVP 的 CTAB提取液和10l-疏基乙醇，混匀；在 65下水浴 40min-1h 其间要经常颠倒混匀。 2. 加入 200l 醋酸钾，混匀，冰浴 15min。10000rpm 离心 10min，取上清约900l。,3、加入等体积的 Tris 饱和酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），在摇床上充分摇动15min；10000rpm 离心10min，取上清 700l。 4、加入 1/10 上清液体积的 Rnase，混匀；37水浴 40min-1h。 5、加入等体积的的氯仿-异戊醇（24：1），摇床上摇动 15min；10000rpm 离心10min，取上清约 500l。,6. 加入 1/10 体积的醋酸钠，2 倍体积的无水乙醇，充分混匀，4冰箱中静置20min。 7. 10000rpm 离心 10min，弃上清。 8. 分别用 75%酒精和无水乙醇漂洗沉淀 2 次，倒掉酒精，将离心管管口朝下，自然晾干。 9. 加入 100l 1TE 溶液溶解 DNA，也可以 50助溶，保存在 4备用。,注意事项,1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀； 2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料；,3）收集 CTAB