蛋白质结晶学和X光衍射基础.ppt

蛋白质结晶学和X光衍射基础,分子酶学工程教育部重点实验室 郑柏松 讲师,生物物理学生物大分子结构解析,授课内容,历史的回顾 X光衍射原理 蛋白质表达、纯化 蛋白质结晶 X光衍射及数据收集 结构解析,授课目的,了解生物物理学发展历史与前沿； 掌握蛋白质结晶学和X光衍射基础知识； 开阔视野贴近国际一流结构生物学实验室； 培养兴趣增强对科研工作的感性和理性认识。,蛋白质三维结构测定方法,X-射线晶体学 电子显微学 (低温电子显微技术与三维象重构） 核磁共振波谱学,1895年德国物理学家伦琴发现X射线并因此获得1901年首届诺贝尔物理学奖，X射线历经110年跨越3个世纪，由于众多学者在探索X射线性质、应用、仪器等方面的创新性研究，先后有29位物理学家、晶体学家、化学家、分子生物学家等分别获得了物理（7项）、化学（9项）、生理学或医学（3项）总计19项诺贝尔奖。,历史的回顾,1912年劳厄获得了X射线通过晶体后产生的衍射斑点图像（劳厄衍射图），证明了X射线的波动性及其波长范围。随后提出了表示原子排列周期与X射线波长间关系的著名的衍射方程（劳厄方程），并成功地解释了晶体衍射的实验结果。 英国物理学家布拉格父子、达尔文等人发展了X射线衍射理论，类比光学反射原理提出了表示晶体结构（晶面间距d）、X射线波长（）与衍射方位（）间的关系的布拉格方程，提出了嵌镶晶体、完整晶体和包含有原子热运动诸因素的衍射强度公式，阐明了X射线通过晶体产生衍射的付里叶变换本质，获得了X射线的连续光谱与取决于阴极材料的特征光谱。,历史的回顾,最终X射线衍射成为有机分子（特别是生物活性分子）立体结构测定的有力工具，为研究生理活性物质（药物分子）的立体结构、结构改造、结构预测、结构功能关系为目标的有机晶体学科奠定了基础。 对于生物大分子的研究，始于30年代中期，贝纳尔和藿奇金开始用X射线衍射方法研究胃蛋白酶的晶体结构，但直到布拉格主持凯文迪实验室后，才使得这一工作取得突破，为创建分子生物学科奠定了基础。 1953年沃森和克里克根据X衍射实验数据建立了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结构，并因此获得1962年的诺贝尔生理学和医学奖。,历史的回顾,肯德鲁和佩卢茨从30年代开始，应用X衍射方法研究肌红蛋白与血红蛋白的晶体结构，历经20多年的艰苦努力，在众多科学家的共同参与下，终于在1960年获得了这两个蛋白质的三维结构，并因此荣获1962年的诺贝尔化学奖。 在1957至1967年的10年中，相继用X衍射方法测定了溶菌酶、胰岛素、胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶的高分辨晶体结构。 戴森豪菲尔和胡贝尔、米海尔因测定紫色细菌光合作用中心的三维结构而获得1988年的诺贝尔化学奖，形成了新的蛋白质晶体学科与结构分子生物学科。,历史的回顾,X-射线,X 射线和可见光一样属于电磁辐射，但其波长比可见光短得多，介于紫外线与 射线之间，约为102 到102 埃的范围。,X光衍射原理,X-射线,X光衍射原理,X 射线和其它电磁波一样，能产生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等现象。但是，在通常实验条件下，很难观察到X 射线的反射。不可能像可见光那样用透镜成像。对于所有的介质，X 射线的折射率n都很接近于1（但小于1），所以几乎不能被偏折到任一有实际用途的程度。 在物质的微观结构中，原子和分子的距离（1 10 埃左右）正好落在X 射线的波长范围内，所以物质（特别是晶体）对X 射线的散射和衍射能够传递极为丰富的微观结构信息。X 射线衍射方法是当今研究物质微观结构的主要方法。 X 射线穿透物质时都会被部分吸收,其强度将被衰减变弱；吸收的程度与物质的组成、密度和厚度有关。在此过程中X 射线与物质的相互作用是很复杂的，会引起多种效应。例如，可以使气体电离；使一些物质发出可见的荧光；能破坏物质的化学键，引起化学分解，也能促使新键的形成，促进物质的合成；作用于生物细胞组织，还会导致生理效应，使新陈代谢发生变化甚至造成辐射损伤。 X 射线散射的过程又可分为两种，一种是只引起X 射线方向的改变， 不引起能量变化的散射，称为相干散射，这是X 射线衍射的物理基础；另一种是既引起X 射线光子方向改变，也引起其能量的改变的散射，称为不相干散射或康普顿散射（或康普顿效应），此过程同时产生反冲电子（光电子）。,衍射的几何方程,布拉格方程,劳埃（Laue）方程,X 射线照射到晶体上发生散射，其中衍射现象是X 射线被晶体散射的一种特殊表现。晶体的基本特征是其微观结构（原子、分子或离子的排列）具有周期性，当X 射线被散射时，散射波中与入射波波长相同的相干散射波，会互相干涉，在一些特定的方向上互相加强，产生衍射线。 晶体可能产生衍射的方向决定于晶体微观结构的类型（晶胞类型）及其基本尺寸（晶面间距，晶胞参数等）；而衍射强度决定于晶体中各组成原子的元素种类及其分布排列的坐标。,X光衍射原理,X光衍射原理,劳埃（Laue）方程和布拉格（Bragg）方程确定了衍射方向与晶体结构基本周期的关系，通过对衍射方向的测量，理论上我们可以确定晶体结构的对称类型和晶胞参数。而X射线对于晶体的衍射强度则决定于晶体中原子的元素种类及其排列分布的位置。,X光衍射原理,What we can do？,挑战和机遇 ？,克隆、表达、纯化 结晶 数据收集及处理 相角的测定 相角的改进（优化） 电子密度图的解释 修正 结构的描述和与功能关系的研究,Structural Biology Processes,Recombinant protein over-expression and purification,Expression systems: Bacteria system Yeast Insect cells Mammalian cells Cell-free system,蛋白质表达、纯化,Some Vectors for E.coli Expression System,蛋白质表达、纯化,Protein Expression in Yeast,Cloning of target gene to vector,Transform to yeast Pichia pastoris,Selection of recombinant yeast strain,Yeast cell culture for protein production,蛋白质表达、纯化,Protein Expression in Insect Cells,After recombination,Cloning of target gene to pFastBac,Transform to bacteria with Bacmid,Bacmid transfected to insect cells,Virus assembly in insect cells,Viruses infect Insect Cells for protein production,Strains for expression: Sf9, Sf21, Hi5,蛋白质表达、纯化,Transient Expression In Mammalian Cells,293E cell can be cultured in suspension medium,Recombinant plasmid with target gene,Transfect to 293E cells with PEI,Harvest cells for protein purification,蛋白质表达、纯化,293EBNA1 Cells With GFP Expressing Vector,A,B,Whole cells on plate; Cells in the same plate to A viewed by GFP florescence,蛋白质表达、纯化,Recombinant Proteins Expression In 293EBNA1 Cells,Lanes: 1. Protein standard; 2. Control whole 293E cells; 3. GFP expressed 293E cells; 4. HCF-1N380 expressed 293E cells; 5. HCF-1N16-363 expressed 293E cells.,Recombinant protein 1 (lane 4),1 2 3 4 5,14,20,31,45,67,94,Recombinant protein 2 (lane 5),GFP (lane3),蛋白质表达、纯化,Cell-free System for Protein Production,Sometimes it can produce soluble protein which can not be expressed as soluble form with cellular system.,Roche: Rapid Translation System (RTS),Rapid protein expression,Toxic protein expression,蛋白质表达、纯化,ProteinProtein Complex Expression and Purification: a. Proteins express separately; b. Proteins co-express in one cell. 2. Protein-Nucleic Acid： a. Protein-DNA Complex； b. Protein-RNA Complex.,Producing Protein Complexes for Crystallization,蛋白质表达、纯化,Methods for production of recombinant protein complexes by in vivo reconstitution in E. coli 1. Use compatible vectors, such as pMR101(p15A ori) and pET15B(pBR322 ori); 2. Use one vector with more than one expression cassettes-polycistronic； Benefits of in vivo reconstitution (coexpression) efficiency one round of expression one round of purification quality coexpression and cofolding of polypeptides in the presence of cellular chaperones may increase yield of functional complex,ProteinProtein Complex Expression and Purification,蛋白质表达、纯化,ProteinDNA Complex,Protein solubility: higher in high salt buffer usually; Protein-DNA complex stability: more stable than protein alone; DNA length and sequence used for crystallization: a. additional base pairs; b. sticky ends; 4. Purification of DNA oligos: HPLC with hydrophobic interaction, C4 etc; 5. Trapping reaction intermediate: disulfide bridge; protein point mutation, etc; 6. Preparation of protein-DNA complexes: mix with extra molar DNA; Crystallization: PEG or MPD in low slat buffer; Example: over 6000 trial for protein-DNA complex.,蛋白质表达、纯化,Protein-RNA Complex,Difficulties: avoid of RNase! 1. Phosphate groups interfere crystal packing; 2. Elongated RNAs pack loosely; RNA engineering: blunt or sticky ends; deletion, replacement, etc; RNA preparation: 1. Synthesis; 2. In vitro transcription;,蛋白质表达、纯化,Protein Modification for Crystallization,Protein inhibitor, partner and monoclonal antibody; Protein post-translational modification; 3. Protein mutagenesis: truncation, mutation, deletion,蛋白质表达、纯化,Purification,Fundamental Purification Techniques Affinity: by tags or antibodies; Ion exchange; Size exclusion; Hydrophobic interaction; Aim: Obtain high purity and homogenous protein sample,蛋白质表达、纯化,蛋白质表达、纯化,Purity & Homogenity,Purity Check SDS-PAGE Homogenity Check Native PAGE, Dynamic Light Scattering(DLS) The DLS profile of a protein is highly predictive of its crystallizability. Proteins with monomodal distributions have a high probability (70-80%) of producing some kind of crystals.,SDS-PAGE,Native-PAGE,蛋白质表达、纯化,Affinity Chromatography,Principle Biospecific ligand covalent attached to the matrix Characteristics Specific； High yield Fusion protein Fusions with oligo-Histidine Fusion with GST Fusion with Protein A ScFv fusions with E-tag Fusion with intein,蛋白质表达、纯化,Ion-exchange,Principle: Based on charge difference among different proteins Characteristics No limitation to sample column Expeditious,蛋白质表达、纯化,Gel Filtration,Principle: According to differences in sizes Characteristics Much limitation on sample volume Low velocity compare to ion-exchange,蛋白质表达、纯化,Crystal,蛋白质的结晶,什么是晶体？ 晶体：由原子（或离子、分子）在空间周期排列构成的固体物质。如果原子（或离子、分子）是按照一种确定的方式在三维空间作严格的周期性的规律排列，即相隔一定的距离，周期重复出现，这样的物质称为晶体或单晶体。晶体一定是固体物质，但是固体物质不一定是晶体。 晶体的分布非常广泛，自然界的固体物质中，绝大多数是晶体。气体、液体和非晶态物质在一定条件下也可以转变成晶体。日常生活中的食盐、糖、水晶、宝石等均为晶态物质晶体。 非晶体：物质内部原子杂乱无章地分布，没有周期性排列的规律，此类固体物质称为非晶体或者称为非晶态物质。 玻璃、塑料、松香、陶瓷、生物制品、纤维、淀粉、多糖、无定形药物等，是固体中常见的非晶态物质。,蛋白质的结晶,如何形成晶体？,蛋白质结晶原理,蛋白质在其溶液中的结晶其实是一种缓慢沉淀的过程。 溶液中存在的作用力有疏水相互作用、静电力、氢键作用力等，当吸引力与排斥力达到平衡时溶液处于稳定状态。当吸引作用增大，或分散的或排斥的相互作用减小时，分子开始趋向与聚集状态。例如在液态环境中，如果生物大分子溶液很浓，没有足够的水维持其溶剂化作用，则分子可能聚集成非晶态沉淀，也可能结晶出来。 常用的使蛋白质沉淀的方法是加入沉淀剂，这种方法是通过降低水的流动性来增加蛋白质的有效浓度。常用沉淀剂：聚乙二醇（PEG），盐（如硫酸铵）。 另外一种方法：减小蛋白质分子间的排斥力或是增大他们之间的吸引力。如加入有机溶剂，改变溶液的PH，温度等。,蛋白质的结晶,蛋白质结晶方法,蛋白质的结晶,蛋白质结晶方法 整批结晶法 透析法 液液扩散法 气相扩散法,整批结晶法(batch crystallization) 这是最古老也是最简单的蛋白质结晶的方法。该方法的原理是瞬间将沉淀剂加入蛋白质溶液中，使溶液突然达到高度饱和状态。如果运气好的话，晶体会逐渐从过饱和溶液中析出并且不需要其他步骤。,蛋白质的结晶,透析法（dialysis） 适用于对于大量蛋白质样品进行结晶。,微量透析法（liquid-liquid diffusion ） 图a和图b中，蛋白质溶液保留在毛细管中。图c中，蛋白质溶液被甩到管底并与膜接触。图d和图e中，毛细管置于盛有渗析液的Eppendorf管中。,蛋白质的结晶,液液扩散法 熔点毛细管中的液液扩散 图示为沉淀剂密度较大时,这种方法是在小孔毛细管中将蛋白质溶液与含有沉淀剂的溶液相互覆盖 ，让其自己缓慢扩散的过程。 蛋白质溶液与沉淀剂以 1:1混合。因此沉淀剂浓度 应为最终所需浓度的2倍。,蛋白质的结晶,气相扩散法,悬滴法 使用带有空穴的盘子，蛋白质溶液的液滴悬挂在盖玻片的下方，盖玻片覆盖在密封有沉淀剂溶液的空穴上方。盖玻片的表面经过硅化处理以阻止液滴在玻璃表面的铺展。,这种方法是利用气相平衡的原理，使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加，达到过饱和状态，最终析出晶体 非常适用于只有少量样品，却要筛选大量条件的情况。,蛋白质的结晶,坐滴法 如果蛋白质溶液表面张力低，在悬滴法中蛋白质溶液在盖玻片上铺展而不能形成液滴，此时可用坐滴法。,蛋白质的结晶,蛋白质结晶条件,杂质、晶核及其他因素如温度、溶液PH值 及振动等都会影响结晶过程。 为使蛋白质结晶，要求： 蛋白质纯度足够高，不含其他化合物。 蛋白质分子表面性质相同，聚集形式均一。 蛋白质溶解在合适的溶剂中。 溶液达到过饱和，使蛋白质形成小的聚集体，作为晶体生长的晶核。晶核形成，晶体才开始生长。 溶液的过饱和度要降至最低水平，避免太多的晶核产生。 晶体生长尽量缓慢以便在结构中达到最大的有序度，方法：改变温度，蛋白质浓度等。,蛋白质的结晶,Protein Sample,Protein Concentration: 5-20mg/ml Salt concentration: as low as possible. If the protein is not soluble, change the pH of the buffer or add small amounts of different salts. Buffer concentration: 5-10mM, 10-20 times lower than the buffer concentration used in the well. (100mM in the first screen). Stabilizer:DTT, EDTA and protease inhibitors. A typical protein buffer is 10mM TEA/HCl, pH7.5, 25mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA and 1mM NaN3.,蛋白质的结晶,Precipitants used in macromolecular crystallization,1. Salts: (NH4)2SO4 2. Volatile organic solvents: Ethanol 3. Long chain polymers: PEG4000 4. Low molecular weight polymers and non-volatile organic compounds: MPD,Table 3. Precipitants used in macromolecular crystallization,Factors affecting crystallization,For macromolecule: purity, stability, modification, etc; Some chemical factors: pH, precipitant, ion strength, specific ions, etc; Some physical factors: temperature, crystallization method, time, etc.,Homogeity: purity is very important; Solubility: dissolve protein to high concentration; Stability: maintain protein as stable as possible; Supersaturation: alter the properties of solution for supersaturation; Association: try to promote ordered association; Nucleation: try to promote the formation of nuclei; Variety: try as many methods as possible; Liquid impurities: avoid impurities in the mother liquid; Preservation: protect plate and crystal from shock and disruption;,Conclusions: some important principles,Screening,Robotic,Manual,Cheap Readily available Allows for creativity,Multitude of conditions Highly reproducible Easy to document and track data Lower consumption of protein,结 晶,蛋白质的结晶,CrystalMation,蛋白质的结晶,X光光源及探测器,收集X光衍射数据的主要硬件设备： X光光源 单色器 X光探测器,X光光源,密封X-射线管（sealed x-ray tubes） 旋转阳极管（rotating anode tubes） 同步辐射 ( Synchrotron Radiation),X光光源密封X-射线管,在密封X-射线管中，阴极发射电子，因为管子处于真空状态，相对于金属阳极，阴极有很高的负电势，电子被加速并以很高的速度到达阳极。阳极通常是铜板。 电子能量的大部份转变成热量。一小部分能量以两种不同的X射线的形式发出来。,密封X-射线管X射线产生原理,铜阳极靶的X-射线管的光谱。,平滑的连续区域是减速（或加速）的带电粒子发出的电磁辐射造成的。 锐锋则是由于电子在阳极物质的原子的内部轨道中发生跃迁时产生的高能电子轰击阳极原子，原子的低能级电子被轰击出来，而高能级电子占据空轨道，在这一过程中便释放出特定波长的X射线。 由于L层的精细结构，K分裂为K1和K2两条谱线。M层的能级很靠近，因此K只是一个单峰。 为了得到光谱中特定波长的谱线，需要一个最小激发电压 。 加大电压或者增大管电流可以增加衍射的强度。 局限性：在聚焦点处电子束对阳极所产生的致热作用限制了X射线管的最大功率。功率太大将毁坏射线管。,X光光源旋转阳极管,与密封X-射线管类似，只是用可旋转的柱体代替固定的金属片。 比密封管的优点是它较高的辐射强度，伴随的缺点是必须连续的抽气以保持其所需的真空度。,X光光源同步辐射,艺术家画的座落于格勒诺布尔法国东南部城市Grenoble的欧洲同步辐射装置。 周长是844.39米。 同步辐射器是一个庞大而且昂贵的装置。环的直径有10到几百米的大小。,X光光源同步辐射（原理）,同步辐射仪是以同步加速器为基础构建而成。 同步加速器是使带电粒子（负电子或正电子）以近光速回转的装置。粒子从线性加速器或辅助同步辐射装置直接注入储存环。 粒子在电场和磁场共同作用下运动。其的轨迹由它们的能量及使带电粒子改变方向的磁场决定。 当粒子束改变方向时，负电子或正电子便向环中心方向加速，释放出电磁辐射，进而释放能量。能量的损失由每次循环的射频输入来补偿。 由于自由运动的电子(和正电子) 是无法量子化的，依赖带电粒子的能量和磁场强度的不同，所产生的辐射的范围很广。,同步辐射的特性,高强度(intensity) 仅用弯曲磁场它就能产生比普通X射线发生器高两个数量级的辐射，而用多极摇摆磁场或波纹磁场能产生更高数量级的辐射。非常适用于衍射能力弱的样品的数据收集。另一个优点是射线的低发散度，这导致清晰的衍射点。 可调性(tunability) 同步辐射在可调性上也与X光发生管不同用单色器可以选取光谱范围内任何合适的波长。 偏振（polarization） 来源于X光管的X射线是非偏振的，同步辐射则是高度偏振的。射线的偏振对原子的反常X射线散射有影响。,X光探测器-获得最终数据,四圆衍射仪,DIP X射线面探测仪,CCD X射线检测仪,ACTOR: Automated Crystal Transfer, Orientation and Retrieval,蛋白质的结晶,Ultimate HomeLab,蛋白质的结晶,HighFlux HomeLab,蛋白质的结晶,Compact HomeLab,蛋白质的结晶,衍射图片,电子密度,三维结构,H K L F Phi?,phi,相角求解,实空间,倒易空间,X射线衍射实验和结构计算过程Fourier变换与Fourier反变换,公式二 根据电子密度计算结构因子,公式一 根据结构因子计算电子密度,公式三 根据原子坐标计算结构因子,结构解析的数学原理,常用的蛋白质晶体学软件分类介绍,相位确定中的软件应用,结构可视化的软件应用,结构描述中的软件应用,Agenda,数据处理中的软件应用,总结,常用的蛋白质晶体学软件分类介绍,Phasing and refinement,Visualization,Structure Description,Data Processing,Automar, DPS, HKL, Mosflm, novel_R, Strategy, XDS, d*TREK,AMoRe, ARP/wARP, CCP4, cctbx, CNS, CONVROT, EPMR, FFFEAR, MADSYS, MAID, MAPUTILS, MOLREP, OASIS2004, SHELX, SnB, SOLVE/RESOLVE, USF, X-plor,O, COOT, QUANTA, XtalView,Conscript, DINO, GRASP, LIGPLOT, MOLMOL, Molscript/Bobscript, MSMS, PROMOTIF, PyMOL, Provay, RASMOL, Raster3d, Ribbons, Setor, SPOCK, TkRaster3d, TOPS, VMD,数据处理中的软件应用, 晶 体 学 计 算 中 的 “ 第 一 步 ”,数 据 处 理 的 基 本 步 骤,数 据 处 理 的 常 用 软 件,目前实验室现在比较常用的处理软件：HKL2000/HKL HKL2000/HKL ： 是目前使用最为广泛的一种数据处理软件包； 在PDB库中有超过80的结构的数据是用HKL2000/HKL处理的； 操作界面清晰，使用方便； 在处理大部分数据的时，Index和Integration较其他软件更有优势。,HKL2000使用范例,数 据 处 理 小 结,对数据的评价标准： 1. Rmerge : 越低数据质量越好，最高壳层的Rmerge最好在50%以下； 2. 完整度(Completeness) : 越大表明数据的完整性越好，最好各壳层的完整度都控制在90%以上（有冰环的情况除外）； 3. 冗余度(Redundancy) : 越大则对密度图的细节贡献越明显，因此数据收集衍射图的张数越多越好； 4. 信躁比 (I/sigma(I) : 表明了衍射点的信号强度，越大数据质量越好，最高壳层不应低于23； 5. 对于MAD数据，还要观察Scale Factor随时间得变化，以确认波长是否发生变化； 对空间群的判断： 由于某些空间群的系统消光完全相同，或者两个不同空间群处理出晶胞参数的某个值相差很小，都会造成判断上的失误，因此应注意及时调整空间群。,相位确定中的软件应用,确定相位的常用基本方法,Phasing,MAD/SAD,MIR/SIR,MR,1. 分子置换法,2.重原子法,3. 直接法,多(单)对同晶置换法（MIR/SIR),多(单)波长反常散射法 (MAD/SAD),MAD/SAD方法中的软件应用,MAD/SAD方法的软件包,Heavy atom search Heavy atom position refinement Phasing Phase improvement: Density modification NCS averaging Phase extend,SHELX SOLVE/RESOLVE CNS/X-plor SnB OASIS2004 CCP4(Mlphare ) ,MAD/SAD主要流程,MAD/SAD 常 用 的 方 法 及 软 件,SHELX (Heavy atom search),SOLVE (Heavy atom position refinement),SOLVE (Phasing),RESOLVE (DM, NCS averaging, High resolution native ),CNS (DM, NCS averaging, High resolution native ),HKL2MAP, SHELXC/D, SOLVE/RESOVE, CNS,Electron Density Map/ Model building,示 例,MAD/SAD 小 结,几乎每种软件都包含了从Heavy atom search到Phase improvement的所有程序；但是各有侧重。 对MIR/SIR的数据处理方法与MAD/SAD方法类似。 对于一般的数据，可以首先选用SOLVE/RESOLVE进行初步计算。 经验总结： 1. SHELX长于Heavy atom search； 2. SOLVE/RESOLVE简单、集成功能较多，方便使用，但DM的效果不是很好； 3. CNS长于Phase improvement，其density modification, averaging的效果明显优于其他软件； 综合使用，取得最佳结果。,MR 方法中的软件应用,MR方法的软件包,Cross_rotation search Translation search,CNS/X-plor Molrep Amore Epmr Phaser ,MR主要流程,MR 常 用 的 方 法 及 软 件,常用的软件包 ： CNS和Amore Amore的特点是界面操作，可建立模型库，计算速度较快，使用方便； CNS的特点是结果较为准确，可调整的参数多，但是速度较慢。,CNS 示 例,数据准备 需要准备的文件包括： 数据文件 ：data.sca 模型的坐标文件 ：model.pdb 数据转换 将数据转换成为CNS可用的格式： a. %to_cns data.sca data.hkl 将数据文件转化成为cns可用的hkl数据文件； b. %cns_solve generate_easy.inp 将模型坐标文件转换为cns可用的mtf和pdb文件。,CNS 示 例,3. 计算交叉旋转函数 修改输入文件 cross_rotation.inp : = molecular structure = * structure file * = structure_infile=“model_cns.mtf“; * coordinate file * = coordinate_infile=“model_cns.pdb“; = crystallographic data = * space group * * use International Table conventions with subscripts substituted by parenthesis * = sg=“I422“; * unit cell parameters in Angstroms and degrees * + table: rows=1 “cell“ cols=6 “a“ “b“ “c“ “alpha“ “beta“ “gamma“ + = a=182.151; = b=182.151; = c=156.690; = alpha=90; = beta=90; = gamma=90; * reflection file * = reflection_infile=“data.hkl“; = output files = = rf_list_outfile=“cross_rotation.list“;,% cns_solve cross_rotation.inp,CNS 示 例,4. 检查交叉旋转函数的结果 ! index, theta1, theta2, theta3, RF-function (EPSIlon= .25) 1 346.447 76.154 326.139 .0684 3 346.137 76.154 280.830 .0628 7 285.790 71.862 253.498 .0383 8 282.100 69.231 273.189 .0369 9 343.569 74.838 345.761 .0361 10 344.661 73.523 298.346 .0359 12 343.124 91.316 279.068 .0347 13 167.319 95.262 94.874 .0338 14 285.696 71.862 207.237 .0335 15 281.550 69.231 228.806 .0331 18 160.300 74.838 81.550 .0326 19 108.554 74.838 101.689 .0321 20 300.003 76.154 261.868 .0319,选取与其他解差距最大的解,CNS 示 例,5. 计算平移函数 修改输入文件 translation.inp : = molecular structure = * structure file * = structure_infile=“model_cns.mtf“; * coordinate file * = coordinate_infile=“model_cns.pdb“; = crystallographic data = * space group * * use International Table conventions with subscripts substituted by parenthesis * = sg=“I422“; * unit cell parameters in Angstroms and degrees * + table: rows=1 “cell“ cols=6 “a“ “b“ “c“ “alpha“ “beta“ “gamma“ + = a=182.151; = b=182.151; = c=156.690; = alpha=90; = beta=90; = gamma=90; * reflection file * = reflection_infile=“data.hkl“; * rotation function list file * = rf_list_infile=“cross_rotation.list“; = output files = = output_