高效液相色谱分析法.ppt

2019/6/25,第二十章 高效液相色谱分析法,一、高效液相色谱法的主要类型和原理 二、高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择 三、高效液相色谱仪 四、高效液相色谱分析方法,high performance liquid chromatograph,2019/6/25,一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph,2019/6/25,概述,高效液相色谱法（high performance liquid chromatography；HPLC）是在60年代末，以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，发展而成的分离分析方法。 它与经典液相色谱法的主要区别是： 流动相改为高压输送、 采用高效固定相、 具有在线检测器、 仪器化。,2019/6/25,二、高效液相色谱法的特点 feature of HPLC,特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,2019/6/25,一、HPLC与经典LC区别,经典LC 与HPLC的主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长 无法在线检测 2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H，n） 分析时间大大缩短 可以在线检测,2019/6/25,高效液相色谱法与经典液相色谱法对比,经典LC HPLC 固定相, 一般规格 特殊规格 固定相粒度（m） 75-500 3-20 固定相粒度分布（RSD）20-30 5 柱长（cm） 10-100 7.5-30 柱内径（cm） 2-5 0.2-0.5 柱入口压强（MPa） 0.001-0.1 2-40 柱效（每米理论塔板数）10-100 104-105 样品用量（g） 1-10 10-7-10-2 分析所需时问（h） 1-20 0.05-0.5 装置 非仪器化 仪器化,2019/6/25,二、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,2019/6/25,续前,2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,2019/6/25,三、高效液相色谱仪流程图,2019/6/25,高压液相色谱法特点：,“三高” “一快” “一广”,高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,2019/6/25,第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,一、高效液相色谱仪的主要类型 二、化学键合相色谱法 三、其他高效液相色谱法,2019/6/25,第一节 高效液相色谱法的分类及基本原理,一、高效液相色谱法的主要类型 液液色谱法 液固色谱法 吸附色谱法 分配色谱法 空间排阻色谱法 离子交换法 亲合色谱法 化学键合相色谱法 胶束色谱法,2019/6/25,2019/6/25,二、化学健合相色谱法,用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上，所形成的填料称为化学健合相(chemically bonded phase)，简称键合相。 键合相的优点： 使用过程官能团不流失； 化学性能稳定，在pH28的溶液中不变质； 热稳定性好，一般在70以下稳定； 载样量大，比硅胶约高一个数量级； 适于作梯度洗脱。,2019/6/25,二、化学键合相色谱法,（一）反相键合相色谱法： 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。 固定相：常用十八烷基（octadecylsily，缩写ODS或C18）键合相； 流动相：常用甲醇-水或乙腈-水。 非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成 。,2019/6/25,1、分离机制,反相键合表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。 非极性烷基官能团具有色散力，硅醇基具有吸附性能，因此，分离机制比较复杂： 疏溶剂理论、 双保留机制、 硕替吸附-液相相互作用模型等。,2019/6/25,疏溶剂理论,当一个非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时，相互产生排斥力，自由能（G）增加，熵减小，不稳定性增加。根据热力学第二定律，系统由不稳定到稳定是自发的，即熵增加是自发的。因此，为了弥补熵的损失，溶质分子中非极性部分结构的取向，将导致在极性溶剂中形成一个“空腔”，这种效应称为疏溶剂或疏水效应。,2019/6/25,疏溶剂理论,在键合相反相色谱法中溶质的保留主要不是由于溶质分子与键合相间的色散力，而是溶质分子与极性溶剂分子得的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可逆的。容量因子k与自由能变化G的关系如下式： lnk=lnVs/Vm G/RT G越大，被分离组分的k越小，保留时间越短。,2019/6/25,2、流动相的极性与容量因子的关系,流动相的极性增大，洗脱能力降低，溶质的k 增大，tR增大； 流动相的极性减小，洗脱能力加强，溶质的k与tR减小。 分离结构相近的组分时，极性大的组分先出柱。适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,2019/6/25,（二）正相键合相色谱法,固定相氰基与氨基化学极性键合相 氰基化学键合相的分离选择性与硅胶相似，但极性小于硅胶，即用相同的流动相及其它条件相同时，同一组分的保留时间将小于硅胶。 氨基键合相与硅胶的性质有较大差异，前者为碱性；后者为酸性。氨基键合相色谱柱是分析糖类最重要的色谱柱也称为碳水化合物柱。,2019/6/25,分离机制,主要靠范德华作用力的定向作用力、诱导作用力或氢键作用力。 用氨基键合相分离极性化合物时，主要靠被分离组分的分子与键合相的氢键作用力的强弱差别而分离，如对糖类的分离等。 若分离含有芳环等可诱导极化的非极性样品，则键合相与组分分子间的作用力，主要是诱导作用力。 流动相的极性与容量因子的关系 在作正相洗脱时，流动相的极性增大，洗脱能力增加，k减小，tR减小；反之k与fR增大。 分离结构相近的组分时，极性大的组分后出柱。,2019/6/25,续前,流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，组分tR，k 出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱 适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等,2019/6/25,（三）离子对色谱法：,离于对色谱法(pairedIOnchromatography，PIC或loripairchromatography，IPC) ，反相离子对色谱法(RPIC) 反相离子对色谱法是把离子对试剂加入极性流动相中，被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子对(离子对模式说)，从而增加了样品离子在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，改善分离效果。,2019/6/25,反相离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离,1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸 2）影响k的因素 a与m的极性有关（同反相色谱） b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱,2019/6/25,常用离子对试剂,分析碱类成分 用烷基磷酸盐为离子对试剂。常用正戊(PIC-B5)、正己（PIC-B6)、正庚(PIC-B7)及正辛磺酸钠(PIC-B8)。 分析酸类成分 常用四丁基季铵盐（PIC-A），如四丁基胺磷酸盐(TBA)等：,2019/6/25,分离机制,流动相（m） 固定相（s） B + H BH+ + RSO3Na RSO3+Na+ (PICB) BH+RSO3 BH+RSO3,2019/6/25,分配系数,反相离子对色谱法的分配系数与液液色谱中的K的含义类似： 分离碱(RNH2)：流动相pH33.5， K=RNH3+PICB-SRNH3+PICB-M 分离酸(RCOOH)：流动相pH=7.5 K=RCOO-PICA+SRCOO-PICB+m RPIC的出柱顺序与RHPLC一致，分配系数k除与RHPLC有同样的影响规律外，还与PIC试剂的碳链长度有关。碳链长度增加，k相应增大，在足够生成离子对的前捉下，保留时间与PIC的浓度关系不大。,2019/6/25,优缺点与用途,避免用普通的HPLC仪器长期进行IEC时，流动相(酸、碱)对泵与慌路的腐蚀。 使反相色谱法得以用于有机酸、碱、盐的分离，如生物碱、有机酸、磺胺类药物、某些抗生素与维生素等。 在测定人体内碱性药物的血药浓度时，有利于与其代谢产物和内源性酸性杂质分离。 PIC试剂的价格较贵,2019/6/25,三 其他高效液相色谱法,一)离子色谱法(Ion Chromatography,简称IC) 以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象, 在七十年代出现、八十年代迅速发展。 传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。,2019/6/25,一).离子色谱法原理,离子交换原理，与传统离子交换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；,低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。,2019/6/25,1.离子色谱具有以下优点,（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；,（2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。,（3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱,2019/6/25,离子色谱法,色谱柱： 阴离子交换树脂柱 抑制柱： 阳离子交换树脂柱 被分离组分： 硫酸盐、硝酸盐 流动相：碳酸钠 检测器：电导检测器,2019/6/25,2、离子色谱装置类型 suppressed apparatus of IC,抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂。,非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。,2019/6/25,离子色谱连续抑制装置图,2019/6/25,离子色谱连续抑制原理图,2019/6/25,3、离子色谱的应用 application of IC,阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm), 流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。,2019/6/25,二) 手性色谱法,固定相或在流动相中加入手性添加剂，分离、分析立体异构体的方法，称为手性色谱法(chiralchromatography，CC)。 手性固定相与对映体(样品)间的作用力： 氢键缔合、偶极作用、-作用、疏水作用及空间位阻等 作用点 “配对”则作用力强，保留时间长；反之则弱，保留时间短。 一般是手性固定相与相反构型的样品对映体作用力强，因此可将对映体拆分。,2019/6/25,手性柱分离实例,色谱柱： 硅胶基体手性固定相，键合配位体：纤维素二糖水解酶 流动相： 含丙二醇乙酸缓冲液 被分离物：心得安 检测器：UVD254nm 机制： 纤维素二糖水解酶与心得安左旋体有强的特效选择性作用。,2019/6/25,三) 亲合色谱法(Affinity chromatography，AC),亲和色谱固定相基体上键合了具有锚式结构特征的配位体。此配位体的官能团与被分离的、结构相似的生物分子之间存在特殊的、可逆的分子间相互作用。 基于样品中的各组分与固定在载体上的配基间的亲合作用的差别而实现分离的。 AC具有专属性的选择性，可用于酶，酶抑制剂、抗体、抗原、受体及核酸等的纯化，、浓缩。,2019/6/25,三)、 亲和色谱(AC) Affinity chromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,2019/6/25,四)、其它色谱法,离于交换色谱法(ion exchange chromatography，IEC) 凝胶色谱法(gel chromatography) 手性色谱法 环糊精色谱法 胶束色谱法 亲合色谱法,2019/6/25,1.离子抑制色谱法,在反相色谱法中，通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离于抑制色谱法（lion suppression chromatograpiay，ISC） 1、适用范围 适用于3.0pKa7.0的弱酸及7.0pKa8.0的弱碱。 2、抑制剂 弱酸(常用醋酸)、弱碱(常用氨水)或缓冲盐(常用磷酸盐及醋酸盐),2019/6/25,2反相离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制 组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液 2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子 3）适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,2019/6/25,3、容量因子及其影响因素,组分为弱酸时： 流动相pHpKa，k值变小， tR 减小。 组分为弱碱： 流动相pHpKb，k值增大，tR增大; 流动相pHpKb，k值变小， tR 减小。 流动相的pH需在28之间，超出此范围可能使键合基团脱落。实验后，应及时用不含缓冲盐的流动相冲洗，以防腐蚀仪器流路系统。,2019/6/25,4、用途,有机弱酸、弱碱与两性化合物的分离，以及它们与分子型化合物共存时的分离。不适用于pka8.0的碱。 离子抑制色谱法与离子对色谱法比较,2019/6/25,四) 环糊精色谱法,以环糊精(或改性环糊精)为固定相，或用环糊精水溶液为流动相的色谱法，称为环糊精色谱法(cyclodextrin chromatography，CDC)。 环糊精是由6-12个-（1，4）连接D-吡喃葡萄糖组成的环状低聚糖。其分子成锥筒形，构成洞穴。穴唇口有羟基，较亲水，穴内较疏水。 在色谱分离过程中环糊精起到一个分子筛的作用。,2019/6/25,五) 胶束色谱法,以胶束水溶液为流动相的色谱法称为胶束色谱法(micellar chro-matography，MC)。 胶束是一个一端为亲水性、一端为疏水性的表面活性剂，当其浓度达到其临界胶束浓度时，疏水性的一端聚在一起朝向里避开亲水性的缓冲液，亲水端朝向缓冲液形成胶束。 分离机制： 该系统具有；固定相流动相-胶束固定相，三个界面、三个分配系数，因此对组分具有较好的选择性。,2019/6/25,六)、 离子交换色谱 ion-exchange chromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,2019/6/25,七)、 离子对色谱 ion pair chromatography,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。,2019/6/25,八)、 排阻色谱色谱 size- exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,2019/6/25,第二十章 高效液相色谱分析法,一、化学键合相色谱的固定相 二、化学键合相色谱的流动相 三 分离条件的选择 四 其他固定相,第二节 液相色谱的固定相与流动相及其选择,high performance liquid chromatograph,2019/6/25,第二节 高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,固定相的条件：,1）颗粒细且均匀 2）机械强度高且耐高压 3）传质快 4）化学稳定性好且不与流动相发生化学反应。,2019/6/25,一 化学健合相色谱法 的固定相,用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上，所形成的填料称为化学健合相(chemically bonded phase)，简称键合相。 键合相的优点： 使用过程官能团不流失； 化学性能稳定，在pH28的溶液中不变质； 热稳定性好，一般在70以下稳定； 载样量大，比硅胶约高一个数量级； 适于作梯度洗脱。,2019/6/25,化学健合相色谱分离机制,一般的化学键合相具有分配作用及一定的吸附作用，吸附作用的大小，视键合覆盖率而定。 用化学反应方法将载体表面上残存的硅醇基除去，称为封尾、封顶或遮盖(endcapping)，所形成键合相称为封尾键合相。这种键合相没有吸附作用。,2019/6/25,1、非极性键合相,这类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基与苯基(可诱导极化)等。十八烷基(octadecylsilyl，ODS或C18)犍合相是最常用的非极性键合相。将十八烷基氯硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基，经多步反应生成ODS键合相。 键合反应简化如下：,2019/6/25,2. 极性键合相,该键合相表面键合的是某些极性基因，如二醇基、氰基、氨基等。 分类： 弱极性键合相：二醇基键合相 中极性键合相：氰基键合相 强极性键合相：氨基键合相 用途：正相色谱的固定相,2019/6/25,3. 弱极性键合相,一般为醚基或二羟基键合相 应用较少,2019/6/25,4. 离子交换键合相,该键合相是以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，在其表面键合上各种离子交换基因。 分类 阳离子交换剂：磺酸基、羧酸基 阴离子交换剂：季铵基 影响因素： pH值：一般在0-8范围内使用； 离子强度：一定浓度的缓冲液,2019/6/25,载体性质；,多数产品采用全多孔YWG、YQG或堆积硅球作为ODS键合相的载体。 载体的比表面决定键合基团的总量，总量大，k大，保留时间长。 涡流扩散项与柱渗透性，取决于载体的形状，以球形为好。 国产品：YWG-C18H37(5、10m)、YQG-C18H37(堆积硅珠，35m)及YWG-C6H5 (5、10m)等。 进口品：Nucieosil C18(球形，3或5m)及Partisil 5-ODS(无定形，5m)等。,2019/6/25,表面覆盖度：,参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例，称为该固定相的表面覆盖度。 覆盖度的大小，决定键合相是分配，还是吸附占主导。Partisil 5-ODS的表面覆盖度为98，即残存2的硅醇基，分配占主导。PartisH 10-ODS的表面覆盖度为50，既有分配又有吸附作用。 封顶键合相只有分配作用，如国内产品YWG-FN是用氟酰胺遮盖了硅胶的一些吸附部位，分离效果良好，但疏水性强，在同样分离条件下，柱压高于普通键合相柱。,2019/6/25,二、化学键合相色谱法的流动相,1对流动相的要求：,1）与固定液不反应 2）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的 3）与检测器匹配： UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 注意:使用前过滤、脱气!,2019/6/25,二、化学键合相色谱法的流动相,2. 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2019/6/25,3. 流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,2019/6/25,4. 流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),2019/6/25,5. 选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,2019/6/25,一) 流动相对分离的影响,高效液相色谱中，良好的固定相容易获得，改善分离效果主要是靠选择流动相。 主要受溶剂种类的影响； k主要取决于溶剂的配比。,2019/6/25,二) 溶剂的强度和选择性,1. 溶剂的极性和强度 2. 混合溶剂的强度 3. 溶剂的选择性,2019/6/25,Snyder溶剂分类法,样品组分、溶剂与固定相三者间的作用力为分子间作用力，组分的分配系数由三者的分子间作用力所决定。 分子间的作用力可分为以下三类： 质子受体作用力 参照物：乙醇 质子给予作用力 参照物：二氧六环 强偶极作用力 参照物：硝基甲烷 选择以上作用力最强的常用溶剂作为参照，将81种常用溶剂分为八类。,2019/6/25,Snyder溶剂分类法,选择不同组别的溶剂，分子间作用力不同，容易造成组分间的分配系数的差别，使改变，以利于组分的分离。 根据各类参照物推算出常用溶剂的极性参数P/和反相洗脱溶剂的强度因子S值。 选择不同极性参数P/的溶剂（正相）或不同强度因子S的溶剂（反相）进行配比，优化分离效果。,2019/6/25,三)溶剂最优方法-四面体优化法,根据色谱类型（正、反相）组成四面体； 寻找被分离组分的容量因子k=3的等洗脱面ABC； 将此等洗脱面视为正三角形按比例配制等洗脱强度的初试溶剂。 用初试溶剂作为流动相，进样，检查分离效果，选择最好的溶剂系统。,2019/6/25,色谱溶剂系统的四面体优化法,2019/6/25,应用实例,11种磺胺混合物的分离 组成溶剂四面体 甲醇、乙腈、四氢呋喃 底剂：水,2019/6/25,应用实例,11种磺胺混合物的分离 寻找等洗脱强度面 用ODS键合相柱与甲醇-水，分离上述混合物。经数次调整配比，在甲醇-水（20.0:80.0）时，样品中保留时间适中组分的k=3（或25）。 tR=t0(1+k) 该号溶剂强度因子：Sab=3.00.2+00.8=0.6 所有配比溶剂系统的强度因子都为0.6。,2019/6/25,应用实例,11种磺胺混合物的分离,按比例配制等洗脱强度的初试溶剂,2019/6/25,应用实例,MeOH-H2O(20:80) CAN-H2O (18.8:81.2) THF-H2O (13.3:86.7) MeOH-CAN-H2O (10.0:9.4:80.6) ACN-THF-H2O (9.4:6.6:84.0) MeOH-THF-H2O (10.0:6.6:83.4) MeOH-CAN-THF-H2O (6.7:6.3:4.4:82.6),2019/6/25,应用实例,11种磺胺混合物的分离 用初试溶剂作为流动相，进样，检查分离效果 最佳流动相： MeOH-CAN-THF-H2O (6.7:6.3:4.4:82.6),2019/6/25,洗脱方式,恒组成溶剂洗脱 用恒定配比的溶剂系统洗脱 梯度洗脱 在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。 优点： 缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度。 缺点： 有时引起基线漂移；重复性不佳。,2019/6/25,续前,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）,2019/6/25,三、分离条件的选择,1,2019/6/25,影响分离的因素 factors influenced separation,1. 影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。,2019/6/25,液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。,2019/6/25,2.流速,流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,3.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,2019/6/25,一)高效液相色谱法的速率理论,1.,2019/6/25,一)高效液相色谱法的速率理论,HPLC是将LC与GC基本原理和实验方法相结合而产生。两者主要差别是流动相性质不同 Van Deemter方程式： GC H=A+B/u+Cu 毛细管开口柱 H=B/u+Cu HPLC H=A+Cu （流动相是液体，粘度比气体大的多，柱温为室温，而且流速至少是最佳流速的3-5倍，综上原因可忽略纵向扩散项）,2019/6/25,图示,back,2019/6/25,影响HPLC色谱峰宽的因素,涡流扩散项A,A=2dp 降低固定相直径dp (3-5m) 降低。采用球形、仄粒度分布（RSD5%）固定相及匀浆装柱。,2019/6/25,影响HPLC色谱峰宽的因素,纵向扩散项 纵向扩散系数: 因流动相黏度大,组分的纵向扩散系数很小,纵向扩散项可以忽略.,2019/6/25,影响HPLC色谱峰宽的因素,传质阻抗系数C GC C=Cs HPLC C=Cm+Csm+Cs 化学键合相，固定液为键合在载体表面的官能团的单分子层 HPLC C=Cm+Csm Van deemter方程在HPLC中的表现形式： HPLC H=A+Cmu+Csmu,2019/6/25,续前,3）传质阻抗项及其影响,2019/6/25,2019/6/25,HPLC分离条件的选择,采用小粒度、仄分布的球形固定相，首选化学键合相，用匀浆法装柱。 采用低粘度流动相，低流量（1ml/min）。 柱温以25为宜。太低，则使流动相的粘度增加。用水溶液为流动相的色谱法（如IEC）可按需升温。,2019/6/25,其他(自学),正相键合相色谱的分离条件 反相键合相色谱的分离条件 反相离子对色谱的分离条件,2019/6/25,四 其他固定相(自学),键合型离子交换剂 手性固定相 亲合色谱固定相,2019/6/25,五、分离类型选择 choice of separation types,2019/6/25,第二十章 高效液相色谱分析法,一、输液系统 二、分离与进样系统 三、检测系统 四 数据记录处理和 计算机控制系统,第三节 高效液相色谱仪,high performance liquid chromatograph,2019/6/25,一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph,2019/6/25,液相色谱仪（2）,2019/6/25,液相色谱仪（3）,2019/6/25,液相色谱仪（4）,2019/6/25,2019/6/25,二、高效液相色谱仪,2019/6/25,三、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,1.流程,2019/6/25,第三节 高效液相色谱仪,微机,级分收集器,2019/6/25,一、高压输液泵,(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,2019/6/25,一、高压输液泵,1、柱塞往复泵,2019/6/25,输液泵的要求：,无脉冲、流量恒定、流量可以自由调节、耐高压、碉腐蚀、适于进行梯度洗脱,2019/6/25,(2)梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,2019/6/25,二、分离和进样系统,完整的分离和进样系统包括进样器、色谱柱、柱的进出口接头及至检测器的导管。 1、进样器 六通进样阀,2019/6/25,1. 进样装置,流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：,2019/6/25,2019/6/25,(4) 高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,2019/6/25,二、色谱柱,2、色谱柱 分析型：内径24.6mm，柱长1025cm 制备型：内径2040mm，柱长1030cm 3、色谱柱柱效的评价 “色谱条件与系统适用性试验”给出分析状态下色谱柱最小理论塔板数、分离度和拖尾因子。,2019/6/25,(5) 液相色谱检测器,2019/6/25,三、检测系统,一) 检测器的要求： 灵敏度高; 噪声低; 线性范围宽; 重复性好; 适用化合物的种类广。,2019/6/25,三、检测系统,可变波长型检测器 光电二极管阵列检测器,2019/6/25,覆盆子指纹谱图,2019/6/25,板蓝根指纹图谱,2019/6/25,三、检测系统,二)、紫外检测器UVD 优点：灵敏度高，噪音低，不破坏样品可用于制备，对温度及流动相流速波动不敏感，可用于梯度洗脱。 缺点：只能检测有紫外吸收的样品；流动相选择有一定限制，检测波长必须大于流动相的截止波长。,2019/6/25,二) 紫外检测器,应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 工作原理为Lamber-Beer定律 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。,2019/6/25,1. 可变波长检测器,原理与紫外分光光度计类似.,2019/6/25,可变波长紫外光测定器示意图,2019/6/25,2. 光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,2019/6/25,2019/6/25,光电二极管阵列检测器,2019/6/25,三) 荧光检测器 （fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,2019/6/25,四). 示差折光检测器 （differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；,2019/6/25,示差折光检测器,2019/6/25,五) 其他检测器,1. 安培检测器 2 蒸发光散射检测器,2019/6/25,第二十章 高效液相色谱 法,一、定性分析方法 二、定量分析方法 三、高效液相色谱 分离方法的选择,第四节 高效液相色 谱分析法,high performance liquid chromatograph,2019/6/25,第四节高效液相色谱分析方法,一、定性分析方法 色谱鉴定法 化学鉴定法 两谱联用鉴定法 两谱联用法（离线） 两谱联用仪（在线）,2019/6/25,二、定量分析方法(与GC类似),1、外标法 以待测组分的纯品作对照物质，对比求算试样含量。 工作曲线法、外标一点法、外标二点法 进样量必须准确，否则宣布误差大。 外标一点法只有在工作曲线通过零点时才准确。,2019/6/25,二、定量分析,2、内标法 工作曲线法 内标一点法 内标二点法 内标对比法 校正因子法。,2019/6/25,三、分离方法的选择 cho