蛋白质核酸沉淀分离技术.ppt

沉淀分离技术,第三章,沉淀和结晶的区别: 形态 成分纯度 结晶:同类分子或离子以规则排列形式析出； 沉淀:无序析出，纯度远低于结晶。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。,生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。 任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。,沉淀法操作步骤 ： 加入沉淀剂。 沉淀剂的陈化，促进粒子生长； 离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。,沉淀能否发生； 沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用； 沉淀剂是否容易除去； 用于食品、医药产品的沉淀剂是否对人体有害。,沉淀过程应考虑的问题：,沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取 优点：设备简单、成本低、原材料易得、 便于小批量生产； 缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质， 或含有大量的盐类，或包裹着溶剂， 产品纯度常比结晶法低， 过滤也较困难。,eg. 从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白和96%99%的白蛋白。,图1 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图,沉淀法分离蛋白质的特点： 生产前期可使原料液体体积很快减小1050倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； 使中间产物保持在一个中性温和的环境； 可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性； 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。,3.2 蛋白质的溶解特性,蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。,图2 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域,表1 影响蛋白质溶解度的参数,3.3 蛋白质胶体溶液的稳定性,防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：,蛋白质周围的水化层（hydration shell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层） 因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。,吸引力,颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。,其他沉淀法,金属沉淀法,聚电解质沉淀法,非离子型聚合物沉淀法,3.4 蛋白质沉淀方法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,中性盐盐析法,成本低，不需要特别昂贵的设备 操作简单、安全 对许多生物活性物质具有稳定作用,一、中性盐沉淀法（盐析法）,盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程 。,得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。,优点,缺点,盐浓度,Salting-in,溶解度,Salting-out,蛋白质和酶均易溶于水，分子中的COOH、NH2和OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。,1、中性盐沉淀蛋白质的基本原理,亲水胶体在水中的稳定因素,电 荷,水化膜,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,等点电时的蛋白质（亲水胶体）,带负电荷蛋白质（亲水胶体）,脱水,脱水,脱水,带负电荷蛋白质（疏水胶体）,不稳定蛋白颗粒,阴离子,阳离子,碱,酸,酸,蛋白质聚集沉淀,带正电荷蛋白质（亲水胶体）,碱,+,+,水化膜,带正电荷蛋白质（疏水胶体）,由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水化膜，暴露出疏水区域。,同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。,选用盐析用盐的几点考虑：,盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济,2、中性盐的选择,阴离子： 柠檬酸根-3酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS- 阳离子： Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+ Rb+NH4+K+Na+Li+,Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。,常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。,（1）溶解度大 （2）分离效果好 （3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 （4）价格便宜，废液不污染环境。,最常用的盐：硫酸铵,缓冲能力弱，具腐蚀性，含N,缺点,优点,（1）加入固体盐法,3、 盐析的操作方法,适用：饱和度高，不增大溶液体积,加入硫酸铵固体的量：查表、计算,查表时 注意温度,饱和度： 在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。,（1）加入固体盐法,20,25,g ：加入固体硫酸铵的质量 S2：所需达到的硫酸铵饱和度 S1：原溶液的硫酸铵饱和度,（2）加入饱和溶液法,适用：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高。,V：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积； V0：原溶液体积； S2：所需达到的硫酸铵饱和度； S1：原溶液的硫酸铵饱和度。,饱和硫酸铵的配制方法 在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至5060，趁热滤去沉淀，再在0或室温平衡12天，有固体析出时达100饱和度。,优点 硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好。 缺点 硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续繁琐，而且透析袋容积有限、盐析速度慢、硫酸铵耗费大。,（3）透析平衡法,方法一：取料液分成等体积几份，冷却至0,4、盐析曲线的制作,各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度（或测定离心上清液）,以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线,蛋白质量(mg)或酶活力,硫酸铵饱和度,蛋白质量(mg)或酶活力,硫酸铵饱和度,方法二,各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度,以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线,蛋白质量(mg)或酶活力,硫酸铵饱和度,蛋白质量(mg)或酶活力,硫酸铵饱和度,5、盐析的影响因素,（1） 离 子 强 度 与 离 子 类 型,S：离子强度为I时蛋白质的溶解度； S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度； KS：盐析常数。,盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系：,当溶剂的温度一定时，对于某一溶质，S0是一常数（溶解度常数）,KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。 KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。,多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低KS ； 大而不规则的蛋白分子KS越大。,KS主要取决于盐的性质：,离子价数,离子半径,介电常数,KS,几种盐的盐析能力的排列次序： 磷酸钾硫酸钠磷酸铵柠檬酸钠硫酸镁,1纤维蛋白 2血红蛋白 3拟球蛋白 4血清蛋白 5肌红蛋白,几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图,KS分段盐析法,分段盐析法,在一定pH、温度条件下，改变离子强度。适用于早期粗提阶段的分步分离。,在一定离子强度下，改变pH、温度。适于后期分离纯化和精制。,（2） 蛋 白 质 浓 度,硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：,当蛋白浓度增加10倍时，盐析时所需硫酸铵的饱和度约减小7%。,适宜蛋白质浓度是2.53.0（25 mg/mL30mg/mL）,（3） pH 的 影 响,蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。,在水或稀盐溶液中测得的等电点与在高盐溶液中测得的等电点结果可能不一样,注意,（4） 温 度 的 影 响,温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。 但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。 在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力丧失。,1）注意饱和度表中规定的温度； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化； 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。,6、注意事项,蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。,二、等电点沉淀法,（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活,未沉淀蛋白质的分率,pH对大豆蛋白质溶解度的影响,利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想。,主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白,例如：工业上生产胰岛素,粗提液,调PH8.0,调PH3.0,去除碱性蛋白质,去除酸性蛋白质,胰岛素,三、有机溶剂沉淀法,许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。,加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。 蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。 有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。,机理分析进展,对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。成本高。,优点,缺点,分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。,2、有机溶剂的选择和浓度的计算,不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。,前提：能与水互溶,V = 需加入100浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度,离子强度,3、有机溶剂沉淀的影响因素,温度,样品浓度,pH值,有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓,通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白质初浓度,样品稳定的pH值范围内，等电点附近,通常溶液中盐浓度以不超过5为宜,四、非离子多聚物沉淀法,20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。,沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。 由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。 聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。 通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。,非离子多聚物沉淀蛋白的原理,操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。 沉淀后有机聚合物较难去除。,特 点：,1）选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。 2）选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。,方 法,聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。,沉淀机理,五、聚电解质沉淀法,蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。,六、生成盐复合物沉淀法,金属复合盐法,有机盐法,无机复合盐法,能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+； 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+； 与巯基化合物强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。,金属离子沉淀蛋白质可分为三类：,实际使用时，金属离子的浓度常为0.02 mol/L。,Zn2+沉淀尿激酶,有机盐法,无机复合盐法,含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去有机酸。,如细胞色素C用45%硫酸铵除杂后，用20% TCA即可将其沉淀。,如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。 可加入乙醚或采用离子交换除去无机盐。,七、其他沉淀法,1、选择性变性法,酸碱变性,热变性,表面活性剂变性,有机溶剂变性,选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为选择性变性沉淀法。,2、亲和沉淀,利用蛋白质与特定的生物或合成的分子之间高度专一的作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术，其沉淀原理是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。,原理,引导产生沉淀的方法有：,离子交联 加入带相反电荷的聚合物 加入带相反电荷的疏水基团 改变pH值，诱导产生疏水沉淀 温度诱导产生沉淀,配基-载体复合物与目的蛋白质的分离,基本过程：,亲和结合,洗 涤,初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀；,所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质,用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来,3.4 核酸的沉淀方法,核酸分离纯化应维持在0-4的低温条件下，以防