实验2研究生PCR产物鉴定及PCR原理应用.ppt

生化与分子生物学技术,周 倜 中山医学院生化教研室,实验室秩序 （时间，物品保管，工作服，分组与值日） 仪器与设备的使用 实验室安全环保,实验室管理与操作规程,实验二 apoB基因多态性分析-PCR产物电泳检测, 电泳的概念,带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定, 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）, 纸电泳 醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电泳的基本原理,利用物质的两个差异来分离物质,电荷差异 电荷性质 电荷数量,分子差异 分子大小 分子形状,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小、构象及电荷数不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。,DNA琼脂糖电泳基本原理,1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素,DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液,1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围,琼脂糖浓度（，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb),0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2,一、电泳前准备,二、制胶,三、上样电泳,基因组DNA 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头， 微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X加样缓冲液 ： 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液; 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液,实验材料,PCR-apoB基因多态性产物的鉴定,取PCR产物全部上样,1.5%胶，电泳（80mA, 120min）,1：Marker 2：待测样品1 3：待测样品2 4: 待测样品3 5: 待测样品4 6: 待测样品5 7：待测样品6,-DNA琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果,琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%胶3mm、凝固后拔梳）,倒缓冲液，加样（取基因组DNA样品液8l+2l上样缓冲液（5），混匀, 上样 ）,电泳（恒压100V 1小时） 检测（紫外检测）,四.操作步骤 （1人1孔）,其余DNA样品交给老师保存，以后实验用。,有关PCR反应,PCR反应体系 PCR过程 PCR的基本原理,有关PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的基本原理,PCR技术的创建,一、最初的理论描述Khorana Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。” 但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,二、PCR技术的发明Kary Mullis 1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼 1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,PCR技术的创建,PCR从构想成为现实 1983年12月， Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。,PCR技术的创建,PCR反应条件 PCR过程 PCR的基本原理,有关PCR反应,94,55,37,?,Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,Saiki, 1988年,PCR技术的发展,72,94,55,PCR循环,普通PCR仪、梯度PCR仪,全新4通道实时荧光定量PCR仪,1988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动化 1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。 1993年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。,PCR技术的发展,Kary B. Mullis（1944）,,PCR仪的变迁,三个水浴锅，用手移动 （Mullis等人当时用的） 电加热块 自来水冷却 （PE，1988） 电加热块 内置循环液冷却 （PE，1989） 三个加热块 机械手 （Strategene，1994） 半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendorf） 空气加热 (Roche) 梯度PCR仪, 实时荧光定量PCR仪 Lab-on-chip式的PCR仪(芯片PCR),全新4通道实时荧光定量PCR仪,普通PCR仪、梯度PCR仪,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,退 火,延 伸,经典循环参数（500bp以内）,94 30s 55 45s 72 1min,94 5min,30次,72 7min,4 forever,PCR技术的特点,灵敏度高 30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝） 将模板从皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个PFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 特异性强 引物序列与模板结合的特异性 快速简便 一次性加好反应液，24小时即可完成扩增,生物学基础研究 目的基因扩增和鉴定 、DNA测序、定点突变 医学临床应用 遗传疾病基因诊断、致病病原体检测 、组织配型 人类基因组工程 遗传图谱的构建、DNA测序、表达图谱 法医学物证鉴定 个体识别、亲子鉴定 其他 动植物检疫、系统进化研究、分子考古学,PCR的应用领域,分子克隆（目的基因的获取和鉴定）,PCR技术应用于科学研究,5,5,Bam H I,EcoR I,Bam H I,EcoR I,PCR(5端引入限制酶识别位点),围绕二硫键构建不同结构的K5缺失突变体（PCR缺失突变）,Yang X（杨霞）, et al. J Cell Mol Med (IF:5.2), 2010.,PCR技术应用于科学研究,2、临床基因诊断,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,PCR技术应用于临床诊断,遗传疾病的基因诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血,珠蛋白链合成不平衡,A,正常人,病 人,正常,病人,A,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),登革病毒的检测,DMD：人类肌营养不良基因,A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失,B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者,C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式,多重PCR检测DMD基因缺失,PCR-RFLP法：(PCR产物限制性酶切片断多态性分析),Ras癌基因,限制性内切酶,突变,限制性内切酶,正常,突变,电泳,个体识别；亲子鉴定 方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性） DNA指纹 PCR-ASO （等位基因特异性寡核苷酸） PCR-VNTR（可变数目串联重复序列）多态性 PCR-STR（短串联重复序列）多态性 PCR-SSCP（单链构象多态性） 线粒体DNA测序,PCR技术应用于法医学鉴定,性别鉴定,女性,男性,Y引物,PCR,男性 女性,PCR-STR(short tandem repeat)多态性检测,PCR；电泳检测,PCR技术应用于法医学鉴定,现场血迹 嫌疑人1 嫌疑人2 嫌疑人3,个体识别,PCR技术应用于法医学鉴定,父 父 子 母,亲子鉴定,PCR技术应用于法医学鉴定,1：Marker 2：阳性模板 3：待测样品1 4：已确诊乙肝病人样品 5: 待测样品2 6: 待测样品3 7: 阳性模板,结果分析,阴性,阴性,PCR-VNTR(Variable numble of tandemly repeated short DNA sequence) 多态性检测,PCR；电泳检测,3VNTR位于该基因3端下游第2个Poly A信号以下位置的一个可变数目串连重复序列，也称小卫星区（minisatellite）。 根据重复序列长度的不同，可分为不同的等位基因型，自从1989年首先发现14种Apo B基因3VNTR等位基因以来，国内外至今已发现22种等位基因，长度在4001200 bp之间. 根据重复序列的内部结构分为两类：ATAATTAAATATTTT，称为X型；ATAATTAAAATATTT，称为Y型。其序列中发生单核苷酸取代（即G或C取代T）， 又可产生X或Y的变异体Xi、Yi、Xii和Yii等。 VNTR重复序列数目的不同，以及每一重复序列内部结构的变化决定了VNTR的高度多态性。apoB 3VNTR序列由两端152个保守序列和中间以15bp核心序列多次重复组成。,有关3 VNTR多态性,小 结,掌握PCR技术的原理及基本步骤 熟悉apoB基因多态性的基本原理和操作步骤 了解PCR技术的广泛应用,思 考 题, Taq DNA 聚合酶有何特性使之可以用于聚合酶链式反应？ 根据自己的实验观察，你认为哪些事项是 PCR 操作成功的关键所在？,1）不对称PCR 2) 反向PCR 3）多重PCR 4）锚定PCR 5）逆转录PCR 6）原位PCR 7) 荧光定量 PCR,PCR的类型,目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限 制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制 性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,不对称PCR,高浓度引物,低浓度引物,反向PCR (reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,多重PCR（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD：人类肌营养不良基因,A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失,B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者,C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式,多重PCR检测DMD基因缺失,LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）,PCR的局限：需了解靶基因片段两侧的序列,对于未知序列怎么办？,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增,PCR固相分析法,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,原位PCR的作用,操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙