实时荧光定量PCR技术,原理,应用及实践,第二代染料.ppt

Real-time PCR 基因表达定量,北京康为世纪生物技术有限公司,2,北京康为世纪生物科技有限公司,康为的目标：成为中国的Invitrogen 完善的产品线 一站式的服务平台,您的问题解决专家！,3,北京康为世纪生物科技有限公司,核酸提取 PCR、RT-PCR 及荧光定量PCR DNA 分子量标准 克隆与转化,蛋白质 学相关,蛋白提取与纯化 蛋白定量、蛋白Marker及蛋白电泳产品 Western Blot产品,免疫学 相关,免疫组化产品 标签抗体 内参抗体 二抗,完善的产品线,4,五大平台 一站式服务,康为世纪生物科技有限公司,5,分子生物学 全系列产品 蛋白质学产品 免疫学相关产品,北京康为世纪生物科技有限公司,我们的客户,我们的合作伙伴,北京大学、清华大学、 复旦大学 中国科学院、军事医学 科学院 301医院、协和医院、 上海瑞金医院 华大基因、诺华制药,Real-time PCR 基因表达定量,北京康为世纪生物技术有限公司,PCR： 国王和象棋的故事,N = 264 -1 = 18446744070309551615,PCR： 伟大的天才发明,Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substances Belief in astrology,PCR：理想与现实,反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能 终点检测，与看家基因对照，所谓 半定量：不可接受。,确定模板初始数量 real-time使qPCR成为可能,模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少，即Ct值越小 模板Log浓度与Ct值呈线性关系,Real-time PCR 应用,定量 基因表达水平检测 定量 基因拷贝数检测 多色标记 SNP检测 高精度溶解曲线分析（HRM）- SNP 高精度溶解曲线分析（HRM）- DNA甲基化分析,Real-time PCR: 发光原理,非特异染料（SYBR Green，SuperGreen） 水解探针（TaqMan 探针） 非水解探针（ Molecular beacon ， Scorpion primer）,染料法qPCR 基因表达水平检测,内参基因(housekeeping gene)选择 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR 墨菲定律：Anything can go wrong that will go wrong!,以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆， 比较两样本中目的基因的相对丰度,- Ct法 成立条件：内参基因 (houskeeping gene) 在相互比较的样本之间表达丰度相同 满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近 - 正负10%,染料法qPCR 相对定量,Housekeeping gene selection,Housekeeping gene 的概念与定义 不同环境，不同生长与病理状态，不同器官、组织、细胞类型之间表达水平恒定 -Actin and GAPDH housekeeping gene expression in asthmatic airways is variable and not suitable for normalising mRNA levels. Thorax 2002;57:765-770,Housekeeping gene selection,Evidence Based Selection of Housekeeping Genes PLoS ONE. 2007; 2(9): e898,Housekeeping gene selection,文献检索，挑选恰当 housekeeping gene 恰当： 有文献表明某基因在给定研究条件下适合用作Housekeeping gene 没有文献表明某基因在给定研究条件下不适合用作Housekeeping gene （特别是-Actin 和 GAPDH ） Housekeeping gene在给定研究条件下的表达丰度最好与目标基因相似,通过实验选择Housekeeping gene 实测多个备选Housekeeping gene 以各备选基因的几何平均数为均一化标准，检验各基因在给定条件下的表达稳定性 参考资料 geNorm 网站 - http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/ Vandesompele et al., Genome Biology, 2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes,Housekeeping gene selection,Housekeeping gene 康为产品,高丰度 ACTB，GAPDH 中等丰度 beta2M 低丰度 HPRT1,染料法qPCR 基因表达水平检测,内参基因选择 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR,样本处理与RNA提取,外界刺激 10分钟 可检测的表达改变 严格平行操作。样品离开定义环境 2分钟内 裂解、固定细胞 Trizon 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 以RNA作PCR阴性对照,CW0580,CW0592,染料法qPCR 基因表达水平检测,内参基因选择 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR,逆转录,逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ 检测何种剪接体？ 是否会有二级结构干扰？ 检测灵敏度是否足够？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？,一步法 or 两步法？,两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。 推荐：工作的初期阶段,RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段,RealSuper 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,染料法qPCR 基因表达水平检测,内参基因选择 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR,反应条件优化,Housekeeping gene 单一特异性产物 反应效率大于90%,反应条件优化,目的基因 单一特异性产物 反应效率接近housekeeping gene 反应效率尽量高,Real-time PCR,总原则与普通PCR相同 避免引物二聚体，避免二级结构 尽量小些 （70 - 300bp) 目标区段位置：考虑目标剪接体 推荐做跨intron设计,引物设计,反应条件优化 Master mix的选择,DNA聚合酶 Primers Dye Buffer and dNTPs Template,CWBIO Real-time PCR系列产品,Master Mix的选择 名副其实,Fast RealSuper Mixture（With ROX） Fast：快速复活热启动DNA聚合酶 Real：应用于Real-time Super：使用新型染料，超亮！ Mixture：包括除引物和模板的一切，还有更多！ ROX：含有ROX染料，适用于需ROX校正的仪器,CW0766,背景知识 PCR热启动,反应准备阶段 环境温度下引物与模板可发生非特异结合 DNA聚合酶低温下亦有一定活性 产生少量非特异产物 少量非特异产物在后续循环中成为特异模板，产生大量非特异产物 对策 热启动DNA聚合酶 用某种方法抑制DNA聚合酶在低温下的活性 反应第一步升温时恢复DNA聚合酶活性,Master mix的优化 DNA聚合酶,Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟 Fast Hotstar 抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒,CW0696,CW0704,Master mix的优化 荧光染料,新型荧光染料(SuperGreen) 激发、发射波长与SYBRgreen近似 对PCR反应抑制更轻微 可使用较高浓度(1uM, SYBR green 0.3uM)更亮，灵敏度更高 较短的链延长时间 对小片段DNA和ssDNA结合更弱 减少背景，有效信号更强 与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于HRM分析 化学性质更稳定 致突变性与毒性更弱,SYBR GREEN 染料,新型荧光 染料,反应条件优化 Master mix的选择,Buffer 添加剂的使用 反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂 其它原理.,使用添加剂,未使用添加剂,Master Mix的优化 对仪器的适应性,康为MasterMix 在多种不同品牌，不同档次，性能各异的Real-time PCR仪上进行优化,Master Mix的优化 对仪器的适应性,某其它品牌 康为,采用cDNA用内参actin引物进行扩增，产物片段100bp。模板浓度进行10倍稀释，稀释5个梯度，每管做2个平行，同时做阴性对照,Master Mix的优化 校正染料,ROX Passive Reference 不参与、不干扰PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 有不同系统，需参照仪器要求选择。,抗污染,污染警报：阴性对照出现阳性结果 污染源：先前PCR产物 对策：尿嘧啶糖苷酶（UNG）尿嘧啶DNA糖基化酶 （UDG） 方法： 反应中用dUTP取代dTTP 反应中加入UNG 反应升温前在37oC孵育数分钟，使UNG降解含UTP的DNA（先前PCR产物）,Trouble shooting,qPCR反应优化 非关键技术外包服务,Housekeeping gene 引物序列？反应条件？ 目标基因 引物序列？反应条件？ 选择试剂，摸索条件，优化参数 两个月？ CoWin解决方案一：Primer assay 客户指定：物种，housekeeping gene，目标基因 客户得到：经实验优化、验证过的引物，反应条件参数，MasterMix 客户下游工作：Real-time PCR 数据获取 CoWin解决方案二：全套qPCR服务 客户指定：物种，housekeeping gene，目