乌龙茶多糖提取工艺及抗氧化作用研究.doc

乌龙茶多糖提取工艺及抗氧化作用研究2011no.8?80?serialno.233chinabrewingresearchrepo乌龙茶多糖提取工艺及抗氧化作用研究周向军,高义霞,袁毅君?,李志刚1,张继z(1.天水师范学院生命科学与化学学院,甘肃天水741001;2.西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州730070)摘要:以乌龙茶为原料,研究不同因素对乌龙茶多糖得率的影响,初步探讨了乌龙茶多糖的抗氧化活性.结果表明,各因素对茶多糖得率的影响为:提取次数>提取温度>提取时间>料液比;最佳提取工艺为提取时间80min,提取温度80c,提取次数3次,料液比1:35.在此条件下,茶多糖得率为15.73%.体外抗氧化试验表明,乌龙茶多糖对羟自由基,超氧阴离子自由基,1,1-二苯基一2一苦基肼自由基均具有一定的清除效果,且清除率随浓度的增大而增加.关键词:乌龙茶;茶多糖;提取工艺;抗氧化中图分类号:0658文献标识码:a文章编号:02545071(2011)08008004extractiontechnologyandantioxidantactivityofpolysaccharidefromoolongteazhouxiangjun,gaoyixia,yuanvijun,lizhigang,zhangji抖(1.collegeoflifescienceandchemistry,tianshuinormaluniversio,tianshui741001,chma;2.collegeoflifescience,northwestnormaluniversi,labzholl73oo7o.china)abstract:theeffectsofdifferentfactorsontheextractionratioofteapolysaccharidefromoolongteawerestudied,andantioxidantactivityoftheextractwasinvestigated.theresultsshowedthattheinfluencingofdifferentfactorswasorderedasextractionfrequencyextractiontemperature>extractiontime>solidliquidratio.theoptimumextractionconditionsweredeterminedbyorthogonalexperimentasfollows:extractiontime8omin.extractiontemperature80c,extractionfrequency3andsolid-liquidratio1:35.undertheseconditions,theextractionratioofteapolysaccharidewas15.73%.theinvitroantioxidanttestshowedthatteapolysaccharidehadcertainscavengingactivityonhydroxylradical,superoxideanionradicalanddpphradica1.thescavengingratehaspositivecorrelationwithteapolysaccharideconcentration.keywords:oolongtea;teapolysaccharide;extractiontechnology;antioxidantactivity乌龙茶也称为青茶.属于半发酵茶,是我国六大茶类之一,原产于福建,其加工工艺一般为杀青一揉捻造型一干燥一发酵一蒸揉一成型【.药理研究表明,乌龙茶具有降血糖,降血脂,抗衰老及预防突变等功能,其中具有药理作用的主要成分是茶多酚,茶多糖和茶褐素等.茶多糖是茶叶中继茶多酚之后发现的又一重要的生理活性物质,具有提高机体免疫力,降低血糖,降低血脂等多种生物活性作用2-.不同原料和制备方法所得的多糖生物活性存在一定差异,研究表明,茶多糖在粗老茶中含量比嫩茶中含量高m,乌龙茶的原料比红茶,绿茶粗老,因此本试验以甘肃康县乌龙茶为原料,在前期研究乌龙茶褐素的基础上,研究提取温度,时间,次数和料液比对乌龙茶多糖得率的影响,并对茶多糖抗氧化作用进行了初步分析,为乌龙茶开发提供理论依据.1材料,试剂及仪器1.1材料乌龙茶采自甘肃陇南市康县.1.2主要试剂vc和dpph(1,1一二苯基.2.苦基肼自由基):sigma公司,nbt(氮蓝四唑),l甲硫氨酸,核黄素,无水乙醇,水杨酸,feso,葸酮等均为国产分析纯试剂.1-3主要仪器真空冷冻干燥(alpha14ld.德国);电子天平(湘仪天平仪器有限公司,bl-3200s);高速冷冻离心机(beck-mancoulter,allegra641d;分光光度计(上海欣茂仪器公司,722)等.1.4方法1.4.1葡萄糖标准曲线的制作采用葸酮硫酸法对乌龙茶多糖含量进行测定阎.分别取0.1g/l葡萄糖溶液0.05ml,0.10ml,0.20ml,0.30ml,0.40ml,0.60ml,0.80ml,用蒸馏水补至1.00ml;分别加入4.00ml蒽酮试剂(2g/l),迅速浸于冰水浴中冷却,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加盖玻璃球,以防蒸发.白水浴重新沸腾起,准确煮沸10min取出,用自来水冷却,室温放置lomin左右,于波长620nm处比色.以同样处理的重蒸馏水为空白,进行比色.以光密度为纵坐标,糖的质量(g)为横坐标,得标准曲线.标准曲线为y=0.0074x.0.0012,相关系数rz=-0.9989.取一定体积的茶多糖溶液,同标准曲线操作并计算茶多糖含量.提取液茶多糖总含量(mg)=样液茶多糖含量(mg)提取液定容体积(ml)样液体积(ml)收稿日期:2011-04.17基金项目:地震灾后新农村建设技术集成与示范(2008bar51b05);2010年甘肃省教育厅项目(1008b一01)作者简介:周向军(1980.),男,讲师,研究方向为生物化学与分子生物学;张继,研究员,通讯作者.研究报告中国酿造2011年第8期总第233期?81?茶多糖得率(%)=茶多糖总含量(nag)/茶叶重量(mg)xlo0%1_4.2茶多糖的制备乌龙茶粉碎后称重一浸提一离心(5000r/min,20min)一滤渣重新浸提一滤液蒸发浓缩至原体积的1,43倍95%vol乙醇醇析过夜(终浓度为80%左右)一冷冻离心(5000r/rain,20min)一收集沉淀一沉淀物用无水乙醇,丙酮,乙醚交替洗涤2次一冷冻干燥至恒重.1.4.3单因素试验提取时间对茶多糖得率的影响:称取1g乌龙茶,提取时间分别为30min,60min,90min,120min,150min,180min,在一定料液比,提取温度和提取次数条件下进行试验,探讨提取时间对茶多糖得率的影响.提取温度对茶多糖得率的影响:称取1g乌龙茶,提取温度分别为35,50,65,80,95,在一定料液比,提取时间和提取次数条件下进行试验,探讨提取温度对茶多糖得率的影响.料液比对茶多糖得率的影响:称取1g乌龙茶,料液比分别为l:10,1:20,1:30,1:40,1:50,在一定提取时间,提取温度和提取次数条件下进行试验,探讨料液比对茶多糖得率的影响.提取次数对茶多糖得率的影响:称取1g乌龙茶,提取次数分别为1,2,3,4次,在一定提取时间,提取温度和料液比条件下进行试验,探讨提取次数对茶多糖得率的影响.1.4.4正交试验设计在单因素试验的基础上,利用spss18.0进行正交试验设计,以茶多糖得率为考察指标,确定乌龙茶多糖最佳工艺条件.1.4.5茶多糖抗氧化活性的研究茶多糖对羟自由基的清除:据王桃云等1删的方法稍作修改.各试管中分别加入不同浓度的样液2ml,9mmol/l水杨酸.乙醇2ml,9mmol/lfeso42ml,最后加入8.8mmol/lh202ml启动反应,37反应30min.以蒸馏水为空白对照,在波长510nm处测量各待测液的吸光度值.考虑到样品本身的吸光度值,以9mmol/l水杨酸.乙醇2ml,9mmol/lfeso2ml,不同浓度的样液2ml,用双蒸水代替h20,为茶多糖本底吸收.计算清除率并进一步计算其ic卯值.清除率的计算公式:清除率(%)=ao-(ax-ax0)/ao100%式中:为空白对照液的吸光度值;ax为加入茶多糖后的吸光度值;a为不加h2o:的茶多糖溶液本底的吸光度值.茶多糖还原力的测定:据赵文红等【】的方法稍作修改.各试管中依次加入o.75mlo2mol/l磷酸盐缓冲溶液(ph6.6),0.75ml1%亚铁氰化钾和0.75ml茶多糖溶液,混匀,50c【=水浴20min;冰浴冷却后,加入0.75ml10%三氯乙酸静置30min,3000r/min,4离心15min;取上清液1.5mln入0.1%feci0.5ml及h208ml混匀后,室温反应10min,混匀后在波长700nm处测定提取液吸光度值为a.,a为vc吸光度值,为零管吸光度值(不加样液,其余同上).vc的还原力=(a.a,茶多糖还原力=(.ai-a0).茶多糖对dpph自由基的清除:据汪海波等f2】的方法稍作修改.准确吸取1.2ml0.1g门ldpph乙醇溶液,加入2.8ml95%vol乙醇溶液,混匀,于波长520nm处测吸光度值,自由基清除率为零.分别准确量取样品溶液0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1.0ml,1.2ml,1.4ml,1.6ml,分别加入1.2mldpph液,并依次加入2.6ml,2.4ml,2.2ml,2.0ml,1.8ml,1.6ml,1.4ml,1.2ml95%vol乙醇溶液混合均匀,测吸光度值为.另外分别准确量取样品溶液0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1.0ml,1.2ml,1.4ml,1.6ml,依次加入3.8ml,3.6ml,3.4ml,3.2ml,3.0ml,2.8ml,2.6ml,2.4ml95%vol乙醇溶液后混合均匀,测吸光度值为空白校正值.以vc作为阳性对照.按下式计算自由基清除率k,并进一步计算其自由基清除率ic如值.k(%)=1一(ai-a?,acx100%茶多糖对超氧阴离子自由基的清除:据陈志科等13】的方法稍作修改.采用光照核黄素产生超氧阴离子自由基的方法.以0.05mol/l磷酸缓冲液(ph7.4)为溶剂,配制3-3xlocaol/l核黄素,0.01mol/l蛋氨酸,4.6xl0.knol/lnbt.分别取上述溶液各2ml,加入不同浓度的样品溶液1.0ml,空白管以1.0ml缓冲液代替样品溶液,置于光照箱中光照30min,取出后以缓冲液作对照,于波长560nm处测定溶液的吸光度值.利用测得的吸光度值计算清除率.清除率(%)=(-a)/aoxl00%式中:a.为空白的光吸收值,a羊为茶多糖的吸收值.1.5统计分析方差分析采用spssl8.0进行方差分析.ic弼计算采用西北农林科技大学李志成和岳田利老师设计开发的ic计算软件(登记号:2009sr044013)进行分析;p<0.05表示差异显着.2结果与分析2.1单因素试验结果由图la可知,在30min90min内,茶多糖得率逐渐上升,随后基本保持稳定,所以提取时间以90min为宜;由图1b可知,在料液比为1:101:40范围内,茶多糖得率不断增加,当超过1:40时,茶多糖得率急速下降,原因可能是其他水溶性物质溶解性增加并开始占据优势14】,因此料液比以1:40为宜;由图lc可知,在温度35ci=80%范围内,茶多糖得率几乎成线性增加,并在90达到最大,当超过90%时,得率开始下降,原因可能是高温使茶多糖降解而得率下降【伺,因此提取温度以90%为宜;由图ld可知,提取次数为2次或3次时茶多糖提取率接近最大,且差距不大,因此从2011no.8?82?serialno.233chinabrewingresearchrepo节约成本等综合考虑选提取次数2次为宜.斛料僻图1提取时间(a),料液比(b),提取温度(c),提取次数(d)对茶多糖得率的影响figure1.effectsofextractiontime(a),solid-liquidratio(b),extractiontemperature(c)andextractionfrequency(d)onextractionratioofteapolysaccharide2.2正交试验设计与分析由表1和2可知,提取温度和提取次数的f值为165.282和281.834,大于r晒(2,2)值19.o0,因此提取温度和提取次数对茶多糖得率有显着影响;提取时间的f值10.642,小于(2,2)值,因此提取时间对茶多糖得率的影响不显着.各影响因素的顺序依次为c>b>a>d,最佳组合为a.b2c,d,即最佳提取工艺为提取时间80min,提取温度80%,提取次数3次,料液比1:35.在此条件下,重复试验3次,茶多糖得率平均值为15.73%,rsd为0.8932%.表1提取工艺优化正交试验设计与结果table1.designandresultsoforthogonalexperimentfortheoptimizationofextractiontechnology试验号得11(8o)1(75)11(35)12.412l2(8o)22(40)14.06313(85)33(45)l3.9642(9o)l2314.075223l13.086231212.1373(1oo)13212.88832l315.729332111.88k.13.47713.12012.42313.42013.09314.28713.02313.303l(313.46012.62314.58313.307r0.3841.6642.160.1】7表2正交试验结果方差分析table2.varianceanalysisoforthogonalexperimentalresults2.3抗氧化活性分析以vc为对照测定其对各自由基的清除率,结果(图2)可知,茶多糖具有一定的还原力,其可作为电子供应者,与自由基反应,从而转化为较稳定的物质,中断自由基链式反应.随着茶多糖浓度的不断升高,其还原力不断增强,和vc相比,茶多糖总还原力低于前者.由图3可知,茶多糖对羟自由基具有一定的清除率,达到0.2g/l后,其清除率基本保持在60%不变.vc和茶多糖对羟自由基的ic如分别为0.0205g/l和0.1289g/l,这说明茶多糖具有较高的羟自由基清除率,虽然低于vc,但乌龙茶茶多糖与其他天然提取物相比较仍具有优势【峪切.由图4可知,茶多糖对dpph自由基具有较好的清除率,to.2g/i1.og/l范围内,对dpph自由基清除率几乎与其浓度成线性关系.vc和茶多糖对dpph自由基的ic50分别为0.0255g/l,0.5233g/l.由图5可知,茶多糖对超氧阴离子自由基具有一定的清除率,在0.21.og/l范围内随浓度增加,其对超氧阴离子自由基清除率研究报告中国酿造2011年第8期总第233期呈不断上升趋势,vc和茶多糖对超氧阴离子自由基的ic卯分别为0.2287g/l0.9181g/l,与其他提取物相比较,其清除效果仍然具有一定优势.综上所述,乌龙茶茶多糖对羟自由基,超氧阴离子自由基,dpph自由基均具有一定的清除效果,且成一定量效关系,抗氧化能力相对而言均弱于vc.2.0l-5j粤1.0o5世qq浓度/(mg?ml.)浓度/(mg?ml)图2vc(a)和茶多糖(b)总还原力的测定figure2.determinationoftotalreducingpowerofvc(a)andteap0lysacchande(b)鋈料烬浓度/(mg?ml)浓度/(mg?ml)图3vc(a)和茶多糖(b)对羟自由基的清除作用figure3.scavengingeffectsofvc(a)andteapolysaccharide(b)onhydroxylradical褂妲瓣烬浓度/(mg?ml)浓度/(mg?ml)图4vc(a)和茶多糖(b)对dpph自由基的清除作用figure4.scavengingeffectsofvc(a)andteapolysaccharide(b)ondpphradical褂煨斛蜒浓度/(mg?m)浓度/(mg?ml)图5vc(a)和茶多糖(b)对超氧阴离子自由基的清除作用figure5.scavengingeffectsofvc(a)andteapolysaccharide(b)onsuperoxideanionmdical参考文献:1赵超艺,王秋霜,卓敏,等.乌龙茶审评方法研究概述j.广东农业科学,2009(12):46.48.【2】陈海霞.茶多糖对小鼠实验性糖尿病的防治作用j】.营养,2002,24(1):8588.3】汪东风,杨敏.粗老茶治疗糖尿病的药理成分分析j.中草药,1995,如如加m,0/懈妲2011no.8?84?serialno.233chinabrewingresearchrepo复合诱变选育茁霉多糖高产菌株冯印,苏安祥,王玉华(吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春130118)摘要:茁霉多糖具有许多优良的化学性质,可以作为中间体合成多种有经济价值的工业用化合物,是一种潜在的重要化工平台产品.以出芽短梗霉y为出发菌株,通过紫外2轮,亚硝基胍3轮复合诱变,高蔗糖浓度(2o%)平板筛选得到6株高产突变株,其中菌株n3茁霉多糖产量质量浓度达1j37.84g/l,比出发菌株产量提高71.22%.关键词:茁霉多糖;紫外;亚硝基胍诱变中图分类号:q93331文献标识码:a文章编号:02545071(2011)08008403screeningofastrain也highpullulanproductivitybycompoundmutagenesisfengyin,suanxiang,wangyuhua(collegeoffoodscienceandengineering,jilinagdculraluniversity,changchun1301l8.china)abstract:pullulanhasmanyexcellentchemicalproperties,whichcanbeusedasanintermediatetosynthesizeavarietyofindustrialcompounds.aureobasidiumpullulanswastreatedbyuvfortwogenerationandntgforthreegenerationmutagenesis.sixmumntstainswerescreenedbyhighsucroseconcentration(20%)plate,inwhichamutantstrainn3withhighpullulanproductivitywasobtained.theproductofpullulanbythisstrainwasupt037.84g/l,whichis71.22%higherthanthatoftheparentstrain.keywords:pullulan;uv:nitrosoguanidinemutagenesis茁霉多糖是由出芽短梗霉(aureobasidiulnpullulans)合成的微生物多糖,是一种天然的水溶性中性葡聚糖,无色,无味,无毒,具有良好的耐热,耐盐,耐酸碱,成膜性,乳化性,可塑性,隔氧性,可以作为中间体合成多种有经济价值的工业用化合物,因此广泛应用于食品,医药,化妆品等行业,是一种潜在的重要化工平台产品口-2.对茁霉多糖的性质及应用国内外已做了大量深入细致的研究,与发达国家相比,我国茁霉多糖的研究及应用情况与之差距很大,目前尚未见规模化商品生产的报道,关键是没有高产菌,本研究试图通过物理和化学复合诱变出芽短梗霉,以期获得茁霉多糖高产菌株,为茁霉多糖工业化生产提供具有应用价值的菌株.本研究报道了以出芽短梗霉y为出发菌株,经紫外2轮和亚硝基胍3轮复合诱变,筛选出一株高产茁霉多糖突变株的结果.1材料与方法1.1材料1.1.1菌株收稿日期:2011-03.17基金项目:吉林省科技厅科技支撑计划(20080251)作者简介:冯印(1986一),女,吉林人,在读硕士研究生,研究方向为食品微生物与功能性食品:王玉华+,副教授,通讯作者.26(5):255257.4萧伟祥,萧慧.茶多糖生物活性与结构的研究进展【j】.中国茶叶,