蕉芋多糖抗氧化性及还原能力的研究

蕉芋多糖抗氧化性及还原能力的研究 李粉玲， 林瑶 （韩山师范学院 化学与环境工程学院，广东 潮州521041） 摘要：以蕉芋地上部分茎叶为原料，采用超声波辅助热水提取并精制蕉芋多糖，通过邻苯三酚自氧 化法、水杨酸法研究蕉芋多糖的抗氧化性对超氧自由基、羟基自由基的清除作用，采用分光光度法测定不 同浓度的蕉芋多糖溶液对亚硝酸钠的清除能力研究结果表明，蕉芋多糖对超氧自由基和羟基自由基具有 良好的清除能力，同时对亚硝酸钠也有一定的清除能力 关键词：蕉芋；多糖；超声波；羟自由基；超氧阴离子；抗氧化性 中图分类号：TS 202.3文献标识码：A文章编号：1007-6883（2016）06-0029-05 韩 山 师 范 学 院 学 报 Journal of Hanshan Normal University Vol.37 No.6 Dec.2016 第37卷第6期 2016年12月 收稿日期：2016-03-22 作者简介：李粉玲（1970-） ，女，广东汕头人，韩山师范学院化学与环境工程学院高级实验师. 蕉芋（Canna edulis Ker Gawl）别名畲鹅草，属于美人蕉科植物，具块状根茎，原产印度群岛、南 美洲，中国南部及西南部有栽培，始载于中国经济植物志 据潮州凤凰镇民间验方，蕉芋味甘、 淡，性凉，入肺、肝、大肠三经，具有清热利湿、解毒消肿、健脾胃功效1 在潮州凤凰镇，蕉芋块茎可煮食或提取淀粉，其淀粉是凤凰镇特色美食畲鹅粉的主要原料本实 验通过超声波辅助热水提取蕉芋茎叶中的多糖，通过邻苯三酚自氧化法、水杨酸法2-4分别测定蕉芋 多糖清除超氧阴离子自由基（O2- ）和羟基自由基（ OH） ，通过铁氰化钾法测定不同浓度蕉芋多糖 溶液的还原能力，通过分光光度法测定不同浓度蕉芋多糖溶液对亚硝酸钠的清除能力，初步评价蕉芋 茎叶多糖的抗氧化活性，为蕉芋的综合利用提供参考 1材料与方法 1.1材料 蕉芋茎叶，采自潮州凤凰镇凤凰山当地蕉芋种植户 1.2主要试剂 95%乙醇、无水乙醇、丙酮、无水乙醚、5%苯酚、葡萄糖、三氯甲烷（氯仿） 、正丁醇、浓硫酸、 高岭土、邻苯三酚（焦性没食子酸） 、硫酸亚铁、水杨酸、盐酸、30%过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷 （Tris） 、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸，均为国产分析纯 1.3仪器与设备 KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司） ；FA2004N精科电子分析天平（郑州 南北仪器设备有限公司） ；752S紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司） ；TDL80-2B型离心机 （广州广一科学仪器有限公司） ；KDM型调温电热套（山东省鄄城永兴仪器厂） ；SHZ-D（）循环水 式真空泵 （巩义市英峪予华仪器厂） ；DJ-10A倾倒式粉碎机 （上海定久中药机械制造有限公司） ； 29 101-1A型数显电热鼓风干燥箱（上海协达计控设备公司通州医科仪器厂） ；玻璃仪器气流烘干器（巩 义市予华仪器有限责任公司） ；ET-Q型气浴恒温振荡器（常州荣冠实验分析仪器厂） 1.4实验内容与方法 1.4.1蕉芋多糖的制备 预处理：原料蕉芋电热鼓风干燥箱倾倒式粉碎机蕉芋粉末（过40目筛） 10 g蕉芋粉末索氏提取器石油醚回流脱脂2次无水乙醇回流脱脂2次（回流时间1 h/次，试 剂用量60 mL/次）烘干恒重（提取率为93.40%） 粗多糖的制备5-7：碘量瓶（蕉芋粉末去离子水质量比为15）超声波清洗仪二次浸提20 min （温度60 、超声波功率50%、料液比130）减压抽滤调温电热套（加热浓缩至12 mL）趁 热加入为浓缩液4倍体积的95%乙醇，置4 冰箱过夜离心收集其沉淀，沉淀物依次用95%乙醇、 丙酮、无水乙醚洗涤真空干燥得粗多糖 粗多糖精制：粗多糖用50 ml蒸馏水溶解，加入Sevage试剂脱蛋白8-9（多糖溶液氯仿正丁醇 =10.20.04）振荡30 min，静置加入适量高岭土脱色20 min，重复多次加4倍量95%乙醇， 置4 冰箱过夜离心收集沉淀，用95%乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤沉淀真空干燥得精多糖 1.4.2蕉芋多糖抗氧化性及还原能力的测定 （1）蕉芋多糖对超氧阴离子自由基（O2- ）清除能力的测定 实验原理： 采用改进的邻苯三酚自氧化法10-11：在碱性条件（pH 8.2）下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成 O2-和有色中间产物，该有色物在波长325 nm处有一特征吸收峰当加入O2-清除剂时，O2-的生 成受到抑制，邻苯三酚的自氧化反应受阻，溶液在波长325 nm处吸收峰减小所以通过测定A325， 可以计算蕉芋多糖对O2-的清除作用 实验步骤： 将50 mmol/LTris-HC1缓冲溶液（pH 8.2）4.5 mL与4.2 mL蒸馏水混匀，于25 水浴中保持20 min 后立即加入5 mmol/L邻苯三酚（25 预热）0.3 mL，混匀，在4 min内，每隔30 s测定OD325，计算邻 苯三酚溶液的吸光值随时间的变化率Ko准确地将蕉芋多糖配成1.0 mg/mL，用蒸馏水将该溶液稀释 成6种浓度：0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL，将1.0 mL不同 浓度的蕉芋多糖与3.2 mL蒸馏水混匀，按上述步骤和条件测定添加样品的邻苯三酚溶液在325 nm处 吸光值，计算其吸光值（Kx）随时间的变化 计算方法： 超氧阴离子自由基清除率的计算公式为 清除率(%)=(Ko-Kx)/KO100%， 其中Ko为空白的平均吸光值，Kx为试样的平均吸光值 （2）蕉芋多糖对羟自由基（ OH）清除能力的测定 实验原理： 采用水杨酸法12-14Fenton反应产生OH，H2O2与2价铁离子混合后产生OH-，其反应方程式为： H2O2+ Fe2+=OH-+ OH+Fe3+OH - 具有很高的反应活性，存活时间短，但在反应体系中加入水杨酸， 捕捉 OH，并产生有色产物，该产物在510 nm处有强吸收若加入具有清除 OH功能的被测物，便 会与水杨酸竞争 OH，从而使有色产物的生成量减少采用固定反应时间法，在510 nm处测量含被 测物反应液的吸光度，并与空白液比较，便能测定被测物对 OH的清除作用 实验步骤： 准确地将蕉芋多糖配成1.0 mg/mL，用蒸馏水将该溶液稀释成6种浓度：0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、 0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL取上述不同浓度多糖溶液各 1 mL，再加入9 mmol/L FeS041 mL、9 mmol/L水杨酸乙醇1 mL，最后加入8.8 mmol/L H2021 mL启动反应，测定OD510，每 个浓度重复三次，取吸光度的平均值 30 计算方法： OH清除率(%)=Ao-(Ax-Axo)/Ao100%， 其中，Ao为不加入蕉芋多糖溶液的空白对照液吸光度值，只加入硫酸亚铁、水杨酸乙醇、过氧化 氢；Ax为加入蕉芋多糖后的吸光度值；Axo为不加过氧化氢引发反应的吸光度值 （3）蕉芋多糖还原能力测定-铁氰化钾法 实验原理： 对于抗氧化剂来说，其抗氧化活性和还原能力之间有着直接的关系抗氧化剂主要是通过自身的 还原作用从而给出电子以清除自由基，因此，其还原能力越强，则表明其抗氧化活性越强，故可通过 测定样品的还原能力来说明其抗氧化活性的大小15-16还原能力的测定是以被测样品是否为一良好的 电子供应者为指标的，其供应的电子除可以使Fe3+还原成Fe2+外，还可与自由基反应，使自由基生成 较惰性更为稳定的物质，以中断自氧化连锁反应，同时，还原能力可能与样品分子结构有关，其分子 的未共用电子对越多，还原能力越强 实验步骤： 分别取0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、1 mg/mL的多糖 样品溶液1 mL 加入 pH6.6的磷酸缓冲溶液和1% K3Fe(CN)6溶液各2.5 mL并混合均匀，混合液在50 下保温20 min之后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，吸取此溶液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%FeC13，混合均匀，30 min后于700 nm波长处测定吸光度 （4）蕉芋多糖对亚硝酸钠清除率的测定-分光光度计法 实验原理： 亚硝酸盐在弱酸性的条件下，与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N1萘基乙二胺盐酸盐偶合生 成红色络合物，用分光光度计测出该化合物的吸光值，就可知道反应液中亚硝酸盐含量多少17-19根 据这一原理比较同一条件下亚硝酸盐含量的多少来反映蕉芋多糖清除亚硝酸盐能力的大小，亚硝酸盐 含量少，清除能力就强，反之则弱 实验步骤： 分别取0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的多糖 样品溶液1 mL加入5.0 mg/L的NaNO2标准液2.0 mL于7支25 mL比色管中37 恒温反应20 min加入 质量分数 0.4的对氨基苯磺酸 2.0 mL 摇匀，静置 5 min 后再加入质量分数 0.2盐酸萘乙二胺 1.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15 min后，在确定的最大吸收波长max540 nm处测定吸 光值A，同时用相应的浸提剂（即去离子水代替蕉芋多糖溶液）做空白实验（Ao）,实验平均三次 计算方法： 清除率SR=(Ao-A)/Ao100%. 2结果与分析 2.1蕉芋多糖对O2- 的清除率 本实验利用邻苯三酚自氧化反 应测定多糖对其产生的O2-清除作 用，在碱性条件下，邻苯三酚发生 自氧化反应，生成有色物质，当体 系中加入O2- 清除剂后，清除O2- ， 阻止中间产物的积累，吸光度降低 由于邻苯三酚自氧化反应机制复 杂，至今尚未研究清楚，无法以精 确的反应速率方程描述其反应过 /% 蕉芋多糖溶液的浓度（mg/mL） 图1不同蕉芋多糖浓度对O2- 清除率的影响 31 程，只能根据反应开始后各反应液的K值变化来对其反应进行分析 由图1可以看出，蕉芋多糖对O2- 在0.1 mg/mL0.6 mg/mL实验浓度范围内表现出量效关系，其对 O2- 的抑制率是随着浓度的增加而递增的0.6 mg/mL1.0 mg/mL的实验浓度范围内趋于稳定 2.2蕉芋多糖对（ OH）的清除效果 羟基自由基的化学性质非常活 泼，可损伤蛋白质、核酸、脂质等 多种生物大分子，尤其对脂质过氧 化的作用最强蕉芋多糖对羟基自 由基的清除率参见图2 羟自由基是生物体内最为活泼 的活性氧图2显示，蕉芋多糖对 Fenton体系产生的OH有一定的清 除作用，在0.1 mg/mL1.0 mg/mL实 验浓度范围内其抑制率随浓度不断 上升，在浓度为 1 mg/mL时对 Fen ton 体 系 产 生 的OH 清 除 率 达 34.11% 3.3蕉芋多糖的还原能力 在试验浓度范围内，还原力测 试混合液的吸光值随着浓度的增加 而增大，见图3 由图 3 可以看出，在 0.1 mg/ mL1.0 mg/mL实验浓度范围内，随 着蕉芋多糖溶液浓度增加，其还原 能力不断增强 3.4蕉芋多糖对亚硝酸钠的清除率 由图 4 可知蕉芋多糖对 NaNO2 的清除率随蕉芋多糖浓度的增加而 增加，当试验体系中加入的蕉芋多 糖浓度达到0.4 mg/mL时再增加用量 时，其对NaNO2的清除率增长比较 快在浓度达到1.2 mg/mL，蕉芋多 糖 溶 液 对 NaNO2的 清 除 率 可 达 22.13 %，说明蕉芋多糖对亚硝酸钠 有一定的清除能力 4结论 本实验对蕉芋多糖抗氧化性进行测定，得出了蕉芋多糖对超氧自由基和羟基自由基具有良好的清 除能力，在0.1 mg/mL1.0 mg/mL实验浓度范围内，随着蕉芋多糖溶液浓度增加，清除能力增强，两 者之间存在着量效关系，对超氧自由基的清除率最大可达39.5% 亚硝酸盐与仲胺在人体和动物体内均能合成亚硝胺，尤其在人和动物的胃中更适于合成亚硝胺19 因此，阻断亚硝胺合成或消除亚硝胺的前体是防治癌病因产生的有效途径之一在模拟人体胃液条件 下，用超声辅助提取的蕉芋多糖提取液，进行清除亚硝酸钠的实验，在一定的多糖浓度范围内，清除 /% 蕉芋多糖溶液的浓度（mg/mL） 图2不同多糖浓度对（ OH）清除率的影响 蕉芋多糖溶液的浓度（mg/mL） 蕉芋多糖吸光值 图3不同浓度的蕉芋多糖溶液的还原能力 图4蕉芋多糖溶液的浓度对亚硝酸钠的清除率的影响 /% 蕉芋多糖溶液的浓度（mg/mL） 32 率随多糖量的增加而增加，清除率最大可达22.13%因此，蕉芋保健品有助于清除体内亚硝酸盐， 对防治癌症病因具有更重要的开发价值 参考文献： 1 唐祥怡，刘军，张执候，等美人蕉的化学成分研究J中草药，1995（2） ：24 2 丁保金，金丽琴，吕建新多糖生物活性研究进展J中国药学杂志，2004，39（8） ：561-564 3 余薇，汪晖，吴基良，等中药多糖的研究进展J咸宁学院学报（医学版） ，2007，21（6） ：548-551. 4 刘杰超，焦中超，周红平，等水果活性多糖的研究与展望J食品科学，2008，29（10） ：675-679 5 许丽丽，庄晓文超声波辅助提取松针多糖的工艺研究J现代食品科技，2012，28（10） ：1376-1379 6 吕明生，王淑军，房耀维，等超声波提取雪莲薯多糖工艺优化及其对羟自由基的清除J食品科学，2011，32 （2） ：24-27 7 车荣珍，吴艳，艾连中，等超声波辅助提取板蓝根多糖的工艺优化J时珍国医国药，2011，22 （10） ： 2498-2501 8 谢丽源，彭卫红，甘炳成桑黄多糖脱蛋白方法与条件优化J西南农业学报，2011，24（1） ：363-365 9 周鸿立，肖振晶，张丽杰，等玉米须多糖的提取及脱蛋白研究J安徽农业科学，2009，37（34） ：10782-17084 10 卢久富西葫芦水溶性多糖抗氧化性的研究J安徽农业科学，2011，39（16） ：9560-9561 11 玄红专，桑青，麻建军邻苯三酚自氧化法测定不同蜂产品抗氧化活性的研究J食品科技，2008，8 （4） ： 137-139 12 冯懿挺，陈绍媛，傅承新植物多糖清除羟自由基作用的研究J分析试验室，2003，22（增刊） ：343-345 13 翟继英光度法测定羟自由基及蔬菜抗氧化性J卫生职业教育，2005，23（7） ：107-108 14 颜军，郭晓强，邬晓勇，等银耳多糖的提取及其清除自由基作用J成都大学学报：自然科学版，2006，16 （2） ：36-38 15 吕喜茹，郭亮，常明昌姬松茸粗多糖抗氧化作用J食用菌学报，2010，17（1） ：69-71 16 OYAIZU MStudies on products of brow ningreaction: antioxidative activities of products brow ningreaction prepared from glucosamine JJpn J Nutr，1986，44：307 17 黄俊生南姜表皮花青素清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究J中国中药杂志，2012，37（2）243-246 18 赵二劳，王晓妮，张海容山楂清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究J食品与发酵工业，2006，32（10） ： 29-31 19 梁英岳，傅亮，孙颖莺，等模拟胃液条件下红豆多肽清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究J食品与发酵工 业，2010，36（4） ：4044 A Study of the Polysaccharides of Canna edulis Kei Gawl, Its Resistance to Oxidation, and Reduction LI Fen-ling， LIN Yao （College of Chemistry and Environmental Engineering， Hanshan Normal University， Chaozhou， Guangdong, 521041） Abstract：With extraction and purification of polysaccharides by way of ultrasoni-aided hot water, using part of the stem leaf on the ground of