凝胶电泳应用于糖蛋白的分离鉴定.ppt

二维电泳应用于糖蛋白的分离鉴定,目 录,糖蛋白,1,糖基化,2,凝胶电泳分离纯化技术,3,基于PAS反应的染色方法,4,糖蛋白（glycoprotein ）,膜蛋白中的糖,膜蛋白分子中的糖,这些寡糖链常常是具分支的杂糖链，不呈现重复的双糖系列，一般由2-10个单体（少于15）组成，未端成员常常是唾液酸或L-岩藻糖。,糖蛋白的结构,单糖的种类 葡萄糖(Glu) 半乳糖(Gal) 甘露糖(Man) N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) 岩藻糖(Fuc) N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc) N-乙酰神经氨酸(NeuAc),连接方式,糖蛋白的结构,糖基化,糖基化 是蛋白质翻译后修饰最重要的方式之 一，是必需的生理过程，对蛋白质生物学功能的 正确发挥起着至关重要的作用。 糖蛋白的形成是糖基化的一种表现形式,糖基化,生物活性,折叠,溶解度,半衰期,抗原性,蛋白质,糖链,糖蛋白,分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤,糖蛋白的分离纯化方法,Capillary electrophoresis,毛细管电泳,MLC,多维液相色谱,electroblottillg,电印迹技术,gelelectrophoresis,凝胶电泳,电泳技术的基本原理,电泳：带电粒子在电场中的定向移动。,等电聚焦(Isoelectro focusing IEF),原理 Pr为两性电解质，不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，因此pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。 EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的,稳定的,线性的pH)。,原理 当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。 如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。 只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。,等电聚焦(Isoelectro focusing IEF),等电聚焦(Isoelectro focusing IEF),返回,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。,电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,插入梳子,聚丙烯酰胺凝胶电泳,加缓冲液,加 样,聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳,剥胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳,标准Marker蛋白的电泳图谱,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶电泳,可直接在胶上对糖蛋白进行酸水解 或酶解后进行后续的鉴定分析或糖链的结构分析。,可以同时分离多个复杂混合物,优势,双向凝胶电泳（二维电泳） 第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。 第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状 。,二维电泳,胶性 PH9 中电 加解 入质 了溶 双液 PH3,加上电场后建立稳定PH梯度,蛋白质溶液加入，建立电场,染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开,第一向 等电聚焦,PI逐渐降低,等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上,第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量逐渐降低,PI 逐渐降低,双向凝胶电泳示意图,二维电泳,染色,二维电泳,1,基于PAS反应的染色方法,3,GelCode糖蛋白染色试剂盒,2,硼酸根 荧光染料,二维电泳中糖蛋白的染色方法,基于PAS反应的染色方法,PAS-periodic acid-Schiffs base method (高碘酸/过碘酸-席夫式碱方法) 原理 在过碘酸的作用下，糖蛋白中糖链上相邻两个碳原子上的羟基被氧化成醛基，醛基再与带有紫外或荧光基团的氨基形成席夫式碱，在紫外或荧光灯下检测即可。 席夫式碱 N原子和C原子双键结合的一类化合物,基于PAS反应的染色方法,酸性品红,丹酰肼 荧光试剂,丹磺酰甘氨 酰肼荧光试剂,Pro-Q Emerald 类染料,过碘酸作用 显紫红色 对还有唾液酸的糖蛋白灵敏 染色7天 灵敏度低g,高碘酸作用 醛基与胺基反应形成腙 染色2天 灵敏度低40 ng 反应条件苛刻,酸性条件