凝胶电泳及Westernblot检测技术.ppt

SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot 检测技术,SDS-PAGE凝胶电泳,实验原理 实验步骤 注意事项 电印迹 SDS-PAGE的优点 SDS-PAGE的缺点 实验常见问题及处理 小技巧,实验原理,背景 基本原理 分类 分离范围 实验中各成分作用,背景,1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。 他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视.,丙烯酰胺,N,N-亚甲基双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,四甲基乙二胺(TEMED),过硫酸胺(AP),激活作用,激活作用,共聚合,基本原理之一,阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 强还原剂巯基乙醇（现在常用二巯基苏糖醇，DTT）打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。,基本原理之二,结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。 这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。,分类,PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类. 连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。,电泳槽,不连续系统,不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,浓缩胶,浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。 当样品液和浓缩胶选Tris/HCl缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。,浓缩胶,电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 Gly- Pro- Cl-,-,+,分离胶,孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使样品很好的分离.当样品进入分离胶,pH,凝胶孔径改变,使慢离子的泳动率变大,超过蛋白,高强度电厂消失.因此蛋白在均一的pH,和电场强度下通过分离胶.如果蛋白质分子量不同,通过分离胶受到的阻力不同，泳动率也不同,因此能够根据蛋白的分子量不同而分开. Pro1- Pro2 Gly- Cl-,-,+,积层胶,分离胶,凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。,浓缩效应,电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。,样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。,分离胶内的电荷效应,与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。,但在SDS-PAGE电泳中，由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别； 此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位（注意SDS结合蛋白质的前提条件是有还原剂DTT，就能更好结合），这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。,SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。,分离范围,凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用515%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：,双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1：29,电转移,经过电泳分离后蛋白质在凝胶中难于进行进一步分析 如氨基酸序列分析、氨基酸组成分析等，需将它们转移至有一定韧性并且化学惰性的高分子支持物上,目前最常用的是PVDF(聚偏氟乙烯)一类膜，其中Perkin-Elmer公司提供的ProBlott膜具有吸附蛋白质能力强的特性，特别适合于氨基酸组成分析和序列分析。 下面介绍两种电印迹方法。,水浴式电印迹方法,（采用Bio-Rad公司的Mini-Protean III系列） 1）将转移膜剪成和凝胶一样大小。 2）将PVDF膜在100%甲醇中均匀润湿（约2-3秒），再在水中漂洗2-3min，然后在转移缓冲液中平衡至少15min。,3）电泳结束后，将凝胶在转移缓冲液中平衡 5min。 4）将凝胶置于也在缓冲液中浸泡过的Whatman 3mm滤纸上，然后将PVDF膜覆于凝胶上，再盖上一张浸湿的滤纸（避免在每一层间留有气泡），最后将它们一起夹入转移盒中。,5）根据需要转移的蛋白质的分子量设定恒定工作电流及转移时间，一般分子量20 KD的蛋白质从0.5mm厚的凝胶上转移可设电压50V，时间约需10-30min，分子量大的蛋白质转移需要的时间相应增加，但是在实验中可以发现，蛋白质的分子量100KD时，即使转移45-60min 膜上吸附的蛋白质的量仍不理想。另外，如果用Tris-甘氨酸缓冲液，电压为40V，需1-4 h。,6）转移完毕后将膜去下在超纯水中漂洗23次，每次5min，以洗去膜上沾有的在电泳和电印迹过程中使用的缓冲液。 如果用做氨基酸分析：转移缓冲液首选 CAPS，这是因为CAPS对以后的氨基酸组成分析、蛋白质序列测定影响小，另外CAPS在pH 11时有很好的缓冲能力，并保证绝大多数蛋白质都带负电荷向正极移动。 Western blot：通常用Tris-甘氨酸系统也可以进行电印迹，但转移结束后需对膜漂洗更完全以去除可能沾附的缓冲液离子及其他杂质。,半干式转移 （Semi-dry transfer）,1、将膜和滤纸剪成和凝胶相同大小。 2、准备转移缓冲液。,阳极缓冲液：0.3M Tris,10%甲醇， pH10.4; 阳极缓冲液：25mM Tris,10%甲醇，pH10.4; 阴极缓冲液：25mM Tris, 40mM 6-氨基己酸，10%甲醇，pH9.4(也可以用40mM甘氨酸代替)。 水浴式转移用的CAPS缓冲液：也可用于半干式转移，但转移效率不及上述系统，尤其当蛋白含量甚少时，希望蛋白质尽量多地转移至膜上以便下一步分析。 我们实验室：25mM Tris 192mM甘氨酸, 无SDS,3、将PVDF膜在100%甲醇中润湿2-3 s，再用超纯水漂洗2-3min，然后在阳极缓冲液中平衡至少15min。 4、电泳结束后将凝胶在阴极缓冲液中平衡5min。,5）在转移槽的阳极板上按以下顺序放置：在阳极缓冲液中浸过的Whatman 3mm滤纸，PVDF膜，凝胶，在阴缓冲液中浸过的Whatman 3mm滤纸。 6）根据需转移蛋白质的特性设置合适的电流及时间，一般原则为1.8mA/cm2, 1 h。由于半干式转移不易散热，电印迹宜在4环境中进行（冰柜或冰库中）。,7）转移结束后，将膜在超纯水中漂洗23次，每次5min，除去Tris和甘氨酸。然后将膜置于滤纸上将其自然晾干后，再在20%甲醇溶液稍微润湿一下即可在白光（如日光灯）下看到灰白色的蛋白质带印迹，因而可省去染色步骤，切下此印迹进一步分析。但是当电泳前样品中含有较多的杂蛋白及盐时，用此法不易分辨，仍需染色。,实验中各成分作用,聚丙烯酰胺 SDS 甘氨酸 上样缓冲液 固定液 染色剂,被激活的单体和未被激活的单体反应开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地通过bis的作用进行交叉互联成为网状结构，最终多聚物聚合成凝胶状，而其孔径大小等特征由聚合条件及单体浓度决定。,十二烷基硫酸钠(SDS),SDS是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，再与PAGE技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量。,SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量的差异将各种蛋白质分开。,当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量。,样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界,而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。,甘氨酸,此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。,上样缓冲液,为什么要上样缓冲液？ 蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。 本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明，仔细区分。,注意事项 分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中含一定量的DTT或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较易区分； 含巯基的试剂有一定的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。,使用说明 1.按每4 l蛋白样品加入1l蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。 2. 100或沸水浴加热35min，以充分变性蛋白。 3. 冷却到室温后离心数秒钟（如果长时间离心会导致甘油分层，需要重新混匀），混均后再离30 s，取上清直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 4. 通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.5 1cm)即可停止电泳。,增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。 指示剂检测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。,甲醇/冰醋酸固定液,甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。 冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.30.5的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。,染色剂,考马斯亮蓝染色 常用染色方法 银染法 金属离子染色法,5电泳（操作）,将聚合好的凝胶板安置于电泳槽中，上样，选择适当的电压进行电泳。,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,水平式电泳装置,电泳缓冲液,凝胶,水平电泳装置,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,染色和脱色,电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣，此外根据不同的研究目的，也可将凝胶直接进行放射自显影及电印迹。,电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片,.结果处理,1）测量并计算分子量（现在已经很少用到） 蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式 Mw K(10bm) (1) lgMw = lgKbm = K1bm (2) 其中MW是蛋白质分子量；K和K1为常数 b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。 mR=dpr/dBPB 2）灰度扫描和分析,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。,相对迁移率,实验注意事项,1. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有：丙烯酰胺、线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。 2. 注意不能随便倾倒单体溶液，应加入过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。,3. TEMED中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化产物呈黄色，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶速度。,4. 过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性剂凝胶)。,5. 激活剂的用量: 激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。增加过硫酸铵或TEMED的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。,6. 温度的影响聚胶的最佳温度为2325 ，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。,7. 氧气的影响氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。通常在较好的真空度(125torr)脱气至少15 min 。,8. 凝胶添加剂：凝胶中常常加入SDS、尿素、Triton X-100等添加剂。SDS加入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。,9. 聚胶时间：虽然应用过硫酸铵TEMED催化后灌胶1520 min即可观察到凝胶的形成，但至少需90 min才能保证95以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大小要求不高，因此不必等很长时间(完全聚合需8 h)。,10. 单体的浓度：是指单体总重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可选择的范围为330，单体浓度增加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。 11. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。,12. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10误差，不可完全信任。 13. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。,14. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。,常见问题及处理办法,纹理和拖尾现象 由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。 蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。,电泳时间比正常要长 可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。 指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率。,5.凝胶时间不对 通常胶在30min内凝聚如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS剂不够或者失效,6.出现“皱眉”（两边向下中间鼓起） 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。,7.出现“鬼带” 如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。,8.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。,SDS-PAGE的优点,设备简单 快速 分辨率和灵敏度高 特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定,SDS-PAGE的缺点,1. 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。,SDS-PAGE的缺点,2. 还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质（如组蛋白F1），含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白（如胶原蛋白）等，它们在SDS-凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进行测定和相互验证。,小技巧,1： 电泳缓冲液的使用： 电泳缓冲液是完全可以回收再用的，但前提是每次的内层缓冲液必须是新配的。每次在电泳完成后内外层缓冲液一起回收到一个瓶里，作为