药物分析抗生素.ppt

,抗生素类药物的分析,进入,返回主目录,思考与练习,第一节 概 述,第二节 内酰胺类抗生素,第三节 氨基糖苷类抗生素,第四节 四环素类抗生素,第五节 抗生素类药物中高分 子杂质的检查,基本要求,基本要求,一、掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系。 二、掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法。 三、掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原理、测定方法与计算。 四、熟悉抗生素类药物杂质检查的方法。 五、了解抗生素类药物中高分子聚合物检查。,返 回,第一节 概述,1. 抗生素药物的特点,化学纯度较低,活性组分易发生变异,稳定性差,2. 微生物学法与理化法的比较,微生物检定法,理化法,以抗生素对微生物的杀伤或抑制程 度为指标衡量抗生素的生物效价,根据抗生素结构特点，利用其 特有的理化性质测定其含量,已知或新发现的抗生素、精致品或 粗制品均能测定,测定化学结构已知、已提纯的 抗生素,灵敏度高、样品需用量小、反映抗 生素的医疗价值，但操作步骤多、 费时、误差大,迅速、准确、专属性高、样品 需用量小、操作简单、省时,3.抗生素的活性以效价单位来表示：,每ml或每mg中含有某种抗生素的有效成分的多少，用单位（u）或g 表示。 1mg青霉素G钠盐定为1667单位 1mg青霉素G钾盐的单位（u） =1667356.4/372.5=1595u/mg,分类（按结构与性质）： 内酰胺类、氨基糖苷类、 四环素类、大环内酯类、 氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类 林可霉素类、其他抗生素类,返 回,第二节 内酰胺类抗生素,青霉素类,头孢菌素类,青霉素,（青霉素钾、钠）,氨苄西林 （氨苄青霉素）,阿莫西林 （羟氨苄青霉素）,普鲁卡因青霉素,头孢氨苄,头孢拉啶,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,酸性,结构特点与性质,一、,与碱金属(Na+、K+)成盐,（一）羧基,易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,（二）手性C,头孢菌素类 C6 C7,青霉素类 C3 C5 C6,旋光性,（三）共轭体系,青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基,UV,（四）内酰胺环,水溶液 不稳定,干燥纯净 稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,例,青霉素的降解反应,（一）呈色反应,1. 羟肟酸铁反应,-内酰胺类,呈色,羟肟酸衍生物,（红、棕、褐）,2. 茚三酮反应,-氨基,蓝紫色,3. 双缩脲反应,似肽键,紫,4. 与重氮苯磺酸反应,橙黄色,重氮苯磺酸,-,-,5,6,OH,H,C,（偶合）,酚羟基,头孢哌酮,5. 与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素 阿莫西林 氨苄西林,（分解）,变色酸,显色,1. K+、Na+的火焰反应,（二）各种盐的反应,2. 沉淀反应（青霉素盐）,遇酸,在过量HCl或 有机溶剂中溶解,3. 重氮化 - 偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,4. 与三硝基苯酚反应,二苄基乙二胺,mp,三硝基苯酚,样品、分解产物,Cu2+,pH3.8,分子重排,2、,IR法,3180cm-1 N-H,内酰胺 C=O,1780cm-1,3470cm-1 O-H,1690cm-1 仲酰胺C=O,1250cm-1 C-O,以阿莫西林为例,对照品对照法,三、杂质检查,药物 检查项目 检查方法 头孢他啶 聚合物 HPLC法 头孢曲松钠 头孢哌酮钠 头孢噻肟钠 头孢呋辛酯 有关物质和异构体 HPLC法 头孢氨苄 有关物质 反相TLC法 青霉素钾（钠） 吸收度 紫外分光光度法,1.头孢他啶聚合物的测定 固定相：葡聚糖凝胶G-10（ 40120m ） 流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液 流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠 对照品溶液：头孢他啶对照品 100g/ml,1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定；重复性用对照品溶液、流动相B测定。 N不低于900，拖尾因子0.751.5，峰面积的RSD应小于5.0%。 2）测定方法 进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%。,2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：ODS 流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38） 1）头孢呋辛酯2-异构体的制备：头孢呋辛酯对 照品+流动相 头孢呋辛酯2-异构体。 2）系统适用性试验：各异构体之间的R1.5，以 头孢呋辛酯A异构体计算n1500。,3）异构体： tR1 相对保留时间 r12=- 1-被测物 tR2 2-标准物 异构体 相对保留时间 判断 B异构体 0.85 供试液谱图中A异构体的峰面积 A异构体 1.0 与A、B异构体峰面积和之比应 为0.480.55。,3.头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法 固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四 烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干 展开剂：0.1mol/L枸橼酸-0.2mol/L磷酸氢二 钠-丙酮（120：80：3） 供试液：本品 50mg/ml 对照液（1）：本品 0.5 mg/ml 对照液（2）：-苯甘氨酸 0.5 mg/ml 对照液（3）：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 0.5 mg/ml,结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（3）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑 点，与对照液（1）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。,4.青霉素钠（钾）的吸收度检查： 供试液 1.80mg/ml， 结果判断：A280不得大于0.10,水解产物,定量过量,剩余,ChP,四、含量测定,反应分两步进行： 1. 水解反应(按化学计算量进行) 2. 氧化-还原反应(无固定的量关系，受温度、PH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),第一步,第二步,V样空,V样,V对空,V对,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰 B、消除样品中其他消耗碘的杂 质的干扰 C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,空白,样品,Na2S2O3,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环 境等条件的影响 B、使本法测定结果与微生物检定 法一致,（1）弱酸性 pH4.5,碱 I2 IO3- + I-,酸 普鲁卡因与碘在酸性条件 下会产生复盐沉淀,（2）温度 2426,温度38 未水解的供试品亦消耗碘,（3）水解时间,以水解20分钟后的耗碘量最大,（4）反应时间,反应20分钟后，耗碘量随时间的 变化较小，可减小含量测定的误 差。,（1）灵敏度高,样品 : 碘 = 1 : 8,（2）反应条件、实验操作要求高,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,4I28I-,原料,制剂,SH,R,OH,-,-,青霉素族,（水解）,青霉素族,ChP,滴定,水解,(降),空,醋酸盐缓冲液,V,(NO3)2,Hg,pH4.6,滴定,样 品,以未经水解的样品作空白测定,（1）水解必须完全,（2）汞盐滴定液用EDTA标定,（3）空白试验 消除已降解产物干扰,（4）优点 不需标准品,可见-紫外分光光度法,（三）,稳定剂,（1）原理,青霉烯酸硫醇汞盐,青霉素族,HgCl2,（咪唑）,（2）方法,对照品法,计算,pH 9,（3）注意,侧链有-NH2时，需加醋酐先 将其乙酰化后才能发生上述 反应,红色,NaOH,羟肟酸衍生物,ChP,特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）,返 回,第三节 氨基糖苷类抗生素,链霉素 双氢链霉素 新霉素 卡那霉素 庆大霉素 巴龙霉素,链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖,巴龙胺,巴龙二糖胺,D-葡萄糖胺,脱氧链霉胺,D-核糖,巴龙霉糖,绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3- 去氧-4-甲 基戊糖胺,庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,多与硫酸成盐,碱性,（一）,链霉素 pH57.5 庆大霉素 pH212,羟基胺结构,氨基糖苷类,H+,糠醛,羟甲基糠醛,-萘酚 蒽酮,呈色,红紫色,甲基葡萄糖胺,巴龙霉素,链霉素,水解,-,N,吡咯衍生物,红色,（Elson-Morgan反应）,庆大霉素,红色,链霉素特征反应,紫红,麦芽酚,链霉胍特有反应,8-羟基喹啉,-萘酚,H+,庆大霉素无UV吸收,（八）色谱法,（1）TLC法：硫酸庆大霉素的鉴别 点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色 对照液 判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位 置应一致。 点样：供试液 对照液：硫酸链霉素标准品 对照液：硫酸链霉素标准品 + 硫酸 新霉素标准品+ 硫酸卡那霉素标准品,判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小 应与对照液 相同， 对照液应显示分离清晰的3个斑点 否则试验无效。 （2）HPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别 比较供试液与对照液各组分的保留时间。,链霉素B（甘露糖链霉素）,方法 TLC中的对照品法（BP）,1. 来源 反应中间体,发酵菌种不同 工艺差别,规定控制各组分的相对百分含量,ChP USP BP JP,+,+,4,10,.,pH,吲哚衍生物,巯基醋酸,邻苯二醛,氨基,max = 330nm,衍生化原理,1.,1-烷基硫代-2-烷基 异吲哚衍生物,RPHPLC,规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%,峰面积归一化法,微生物检定法 各国药典主要采用,HPLC法 常用于体内药分,返 回,第四节 四环素类抗生素,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,四环素（TC）tetracycline,金霉素 (CTC) chlortetracycline,氯四环素,土霉素 (OTC) oxytetracycline,氧四环素,多西环素 (DOXC) doxycycline,脱氧土霉素,美他环素（METC） metacycline,pH3 7.5 荧光,（二）旋光性,1.,差向异构化,差向金霉素,差向四环素,金霉素,四环素,-,4,-,4,6,2,pH,淡黄黑,蓝色荧光,差向四环素,（土霉素、多西环素不易差向异构化）,（1）酸性下降解,max = 445nm,max = 435nm,橙黄色,脱水四环素,TC,ETC,ATC,EATC,（2）碱性下降解,异四环素,四环素,盐酸土霉素的鉴别,EDTA 克服痕量金属造成的 拖尾现象,比较保留时间,三、,特殊杂质检查, 4-差向四环素（ETC） 脱水四环素（ATC） 差向脱水四环素（EATC） 盐酸金霉素（CTC）,HPLC法（2000版）,盐酸四环素,四环素有关物质TLC图,4,0.5,0.5,2,nm,max,355,268,l,、,盐酸四环素,杂质吸收度,取供试品配成每毫升10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm处测定，其吸收度不得超过0.12。,应严格控制温度和时间,HPLC法,盐酸四环素的测定 系统适用性试验：盐酸四环素、有关 物质及ATC峰间的 分离度均应符合要 求。 定量方法：外标法以峰面积计。,返 回,第五节 抗生素类药物中高分子 杂质的检查,1.高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。,蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。 药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。,外源性杂质,内源性杂质,3.高分子杂质的质控方法 （1）凝胶色谱法测定高分子杂质：使高分子杂质 与药物分离。 （2）高分子杂质的控制方法-自身对照外标法 原理：测定在Kav=0处 药物缔合物的峰响应 指标 样品中高分子杂质的响应指标 按外标法计算，得样品中高分子杂质 相当于药物本身的相对含量。,（3）高分子杂质的分析方法 简单测定系统：葡聚糖凝胶G-10（40 120m）柱. HPLC系统:葡聚糖凝胶G-10柱.,返 回,练习与思考,A型题,1. 硫酸链霉素、硫酸青大霉素的鉴别方法是 A.三氯化铁反应 B. 硫色素反应 C. 茚三酮反应 D.与碱性酒石酸铜试液反应 E. 双缩脲反应,2. 青霉素钠中