FL0903细胞破碎.ppt

第三章 细胞破碎 (Cell Disruption),知识点：,细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。 重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备。 难点：常用破碎方法的合理选用。,概 述,一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位成分等。 这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固-液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。 但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。,胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身：单细胞蛋白（SCP） 胞内产品：碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等,概 述,几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物,部分微生物胞内酶,什么是细胞破碎技术？,细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。,第一节 细胞的结构和破碎阻力,1、细胞的结构,细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。 真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。,2、破碎阻力分析,微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的,3、细菌细胞壁的结构,细胞膜的结构,细菌肽聚糖结构示意图,几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。 短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala。而且短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。,细菌细胞壁的主要组分,革兰氏阴性菌与阳性菌差别,虽然几乎所有的细菌都含有肽聚糖的网状结构，但是革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。革兰氏阴性菌比阳性菌复杂，在电子显微镜超薄切片观察，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有2080nm的肽聚糖层，约占细胞壁成分的4090，此外细胞壁还含有大量磷壁酸(eichoic acid)。而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅23nm，占细胞壁成分的10左右，由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较厚的外壁层(约810nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。,革兰氏阴性菌与阳性菌差别,说明,小结,破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,4、酵母细胞壁的结构示意图,破碎酵母细胞壁的阻力,酵母细胞壁的结构示意图如图所示，细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。 与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。,5、红面包霉菌(Neurospora crassa)的细胞壁结构示意图,主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以-1,3糖苷键连接，某些以-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层(a)是-和-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,各种微生物细胞壁的结构与组成,细菌对破碎的敏感度,6、植物细胞壁的化学组成和结构,植物细胞初生壁的化学组成,次生细胞壁,某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4m以上)，常有三层组成。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。,第二节 细胞破碎和产物释放原理,破碎方法,目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎主要有三种方法： （1）化学破碎法 （2）机械破碎法 （3）化学和机械破碎法结合,化学破碎法,又称化学渗透法（chemical permeation) 原理：利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体（protoplast）后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。,机械破碎法,细胞所受的力：压缩力和剪切力。 细胞破碎仅为目标产物的释放创造了条件，而不是最终目的。,破碎方法小结1,破碎方法小结2,机械破碎法与非机械法比较,一、机械破碎,是工业规模细胞破碎的主要手段 主要基于对物料的挤压和剪切作用。 主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破碎等,1、高压匀浆法（High-pressure homogenization）大规模细胞破碎常用方法,高压匀浆器（High pressure homogenizer）,操作原理,Manton Gaulin高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。 在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,高压匀浆法适用的范围,酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度可达到20%左右。 团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。,高压匀浆法使用时注意事项,高压匀浆器的操作温度上升约/10MPa 为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。 多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性,高压匀浆器的种类,高压匀浆器的种类较多 WAB公司的AVP Gaulin 31MR型，最大操作压力为24MPa，最大处理量为100dm3/h Bran and luebbe 公司SHL40型，最大操作压力为20-63MPa，最大处理量为为2.6-34 m3/h,影响破碎的主要因素,压力、温度、通过均浆器阀的次数 升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约175 MPa的压力下，破碎率可达100，但是也有试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢，在工业生产中，通常采用的压力为55-70Mpa。,2、珠磨（Bead mill）,高速珠磨机（High speed bead mill） 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机 。,高速珠磨机工作原理,水平位置的磨室内放置玻离小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。在料液出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，易造成某些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。,Netzsch LM-20型珠磨机,3、撞击破碎,4、超声波破碎（Ultrasonication）,超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。,超声波破碎的机理,一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation），空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。,超声波破碎的适用范围,超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差， 超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，另超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。故主要用于实验室规模的细胞破碎。,超声波破碎图示,超声波细胞粉碎机,二、非机械法,非机械方法很多 酶解 渗透压冲击 冻结和融化 干燥法 化学法溶胞 其中酶法和化学法溶胞应用最广。,1、酶溶法（Enzymatic Lysis） （1）外加酶法,酶溶是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阴性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。,常用的溶酶,常用的溶酶,溶菌酶、 -1，3-葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,使用时需注意的问题,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,酶解法的优缺点,优点： 发生酶解的条件温和 能选择性地释放产物 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于后步分离等 缺点： 溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,（2）自溶法,自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。可是，改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,2.化学渗透法（Chemical permeation）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,化学法,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等 合成的表面活性剂可分离子型和非离子型，离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型）。非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等,特点,化学法和酶法一样也存在对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。但该法容易引起活性物质失活破坏，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。另外，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。,3、渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。,4、冻结-融化法,将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。 但只适用于细胞壁较脆弱的菌体；破碎率较低，常需反复多次；冻融中，可能引起某些蛋白质变性。,5、干燥法,经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。,三、目标产物的选择性释放,破碎的目的是要得到一种或几种目标产物，因此，在细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标产物、而使其它物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，对下游的分离纯化操作的顺利实施是非常重要的。 利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释放速率常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎的进行缓慢释放出来。因此，选择发现地释放目标产物是可能的。 关键是要知道目标产物的性质和在细胞同存在的位置，选择适当的破碎方法和操作条件。,选择性释放目标产物的一般原则,（1）仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、渗透压冲击法和冻结-融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法 （2）选择性溶解目标产物。 当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液PH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。同时，溶液性质应使其他杂质不易溶出。另外机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。,第四节 包含体的分离和蛋白质复性,概述,重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素、人干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒包含体（inclusion bodies IBs）,1、包含体,包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些 基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包含体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机理研究提出了新的课题。,2、包含体的形成,机理尚不完全清楚，但一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态之间疏水性相互作用的结果。,3、目标蛋白的复性,包含体（inclusion bodies）是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。 低蛋白质浓度有利于获得较高的复性收率。,4、基因工程包涵体的纯化方法,几种常见的工艺路线（一）,特点：利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点：要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。,几种常见的工艺路线（二）,路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片却和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留，因此这条路线的问题比较多。膜分离的优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。,几种常见的工艺路线（三）,是用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。,包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）,牛生长激素分离提取,来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细