《核酸的序列分析》PPT课件.ppt

第五节 核苷酸序列分析,即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam-Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。,测序的常用方法,5.1. Sanger双脱氧链终止法(dideoxy-termination sequencing) 原理：双脱氧（2，3）-核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3 端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。,不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来,测序过程: 1.模板与引物杂交 2.引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 3.电泳 4.放射自显影得到直读图象,添加 DNA polymerase 所有4 dNTPs 其中一种标记的ddNTP,ddTTP ddCTP ddGTP ddATP,在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP.,每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs 处,5,反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基. 电泳结构通过显色指示.,3 C C T T T A G C T 5,5.2Maxam-Gilbert化学裂解法,化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。,一、化学裂解法测序的原理,1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列,碱基特异性修饰及裂解,化学法读序,每组测序图谱为4条垂直的阶梯带，该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和C+T两列中含有所有相差一个碱基的DNA片段。如果G+A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。 从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内,化学裂解法的特点,优点： 1、所测序列直接来源于所测 DNA ，避免了 DNA 复制中错误 dNTP 的掺入。 2、可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲基化修饰等，以及研究 DNA 的二级结构及蛋白质与 DNA 的相互作用等。 缺点： 操作复杂，读序困难。,5.3 DNA测序自动化和大规模测序,特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h,DNA自动测序与手工测序的不同点,1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物 2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳，提高电泳分析的效率 3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑,DNA序列测定的自动化 1. DNA测序步骤与自动化 1）模板制备 可自动化 2）定序反应 可自动化 3）凝胶电泳 自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。 4）核苷酸序列阅读与计算机输入 可自动化 2.自动测序仪 Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。 红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP） 兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）,目前市场上已经有各种型号的DNA自动测序仪可供选购。,“分子生物学研究方法”思考题： 1、常用的核酸的凝胶电泳是哪两种？它们分辨DNA片段的范围有何不同？ 2、电泳操作的基本程序有哪些？ 3、核酸的分子杂交的概