各类标本的规范化处理.ppt

临床微生物实验室规范操作势在必行 标本处理,严峻的感染形势,感染性疾病并没有象人类曾经所预料的那样随着抗感染化疗时代的到来而逐一销声匿迹。多种原因造成的易感人群增加; 多重耐药菌如甲氧西林耐药的金葡菌（MRSA）、产ESBL的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌、泛耐药的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等不断涌现并持续蔓延，原先少见的病原如曲霉菌、念珠菌等深部真菌越来越常见; 新发感染病原如SARS、禽流感、手足口病、甲型H1N1流感等也此起彼伏，感染性疾病仍然是人类关注的热点。,低血压发生后第1h(H1)内接受有效抗生素治疗者： 存活率 79.9% 低血压发生后接受有效抗生素每延误1h：存活率平均降低7.6%,早期有效的抗生素治疗: 6h黄金时间,Crit Care Med 2006; 34:15891596,Mortality risk,选择什么药?,复杂的感染源 复杂的细菌获得性耐药机制 复杂的医院感染原因. 医院感染90%病原为条件致病菌,引起外源或内源感染. 多重耐药的细菌感染已成为医院感染的重要内容,医生希望实验室的支持,医生无助, 担忧 渴望快速、正确的病原学报告,可得到共识的方法,初始治疗可根据医生的经验、参考指南、耐药监测结果 同时采集标本做相应的病原检测 24-48h获得培养结果修正治疗方案,临床微生物实验室的主要任务,对微生物标本做出快速、准确的检验报告，及时满足临床的需要； 进行有关抗菌药物耐药性方面的各种试验，受理抗菌药物合理应用的咨询； 密切结合临床，与临床医师讨论、研究及处理有关感染性疾病的问题； 参与抗菌药物临床合理应用的管理和医院感染监测、控制和管理,7,世界卫生组织（WHO）对临床微生物实验室提出三项指导性方针：,（1）临床微生物实验室尽可能把目标集中在快速诊断方面； （2）显微镜检查对建立快速的初步诊断具有很大价值； （3）实验室人员必须主动与临床结合，将实验室数据转化为临床有用的信息。,快速报告,（1）初报：2小时内报告原始标本直接所见，包括急症电话报告规定； （2）预报：次晨或24小时内报告培养初步结果和标本直接药敏试验结果； （3）最后报告：内容为细菌系统鉴定结果和纯菌药敏结果等，一般在48小时内完成，最迟不超过3天。随着医院网络建设的完善，院内网快速报告不同阶段的微生物检验结果将成为今后一段时期的发展方向。,标本处理,血液培养相关问题 脑脊液相关问题 粪便相关问题 生殖道标本相关问题 脓,吸出液及组织标本相关问题 痰标本相关问题 咽标本相关问题 真菌培养相关问题 尿标本相关问题,血培养 主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌 以下菌应视为非病原菌(除非1次血培养分离出)：芽孢杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌,从两个独立的皮肤位点采血，每瓶采集10ml,#1,35C 空气中孵育5天 每天检查浊度并翻转培养瓶,#2,#3,当培养瓶显示细菌生长时进行革兰染色和传代培养,厌氧瓶接种血平皿厌氧血平板+巧克力,需氧瓶接种巧克力平皿和血平皿+沙氏,#4,将重要的革兰染色结果尽快通知临床医生,对重要病原菌 进行鉴定 和药敏试验,#5,例如：肺炎克雷伯菌,例如：肺炎链球菌, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,血培养诊断败血症,败血症是一个非常严重的问题. 血液中的微生物在3分钟内到达每个器官. 在死于败血症的患者中,尽管采用抗生素给与合适的治疗，1/4的人死亡时，血中循环的微生物为10/cc或更少,Septicemia,微生物或其产物在血液中引起疾病,体积 % 阳性血培养结果 vs. 采集的套数,%,99%,89%,80%,真阳性,20 ml/套,Mayo Clinic Study,立即获得足够血液并且开始抗生素治疗,从不同部位获得2-3套血培养(40-60ml血液) 最好在5分钟内采集,#1,#2,采集血培养时间的重要性,9% +,14% +,9% +,11% +,发热高峰前12-2.5小时,发热高峰前2.5-0.5小时,发热高峰期间,发热高峰后1-12小时,166 病人,105 病人,199 病人,258 病人,Thomson et al. 1991. ASCP. Mayo Clinic Study,CLSI M47A对血培养需氧瓶和厌氧瓶 分配的规定:,根据文献，厌氧瓶除了检出厌氧菌，另外对葡萄球菌，肠杆菌科细菌以及苛养菌的检测有优势 另外，针对有关选择性做厌氧瓶的观点，CLSI的准则认为目前没有选择性的标准，为避免漏检，需要常规做厌氧瓶,华山医院 需氧瓶不长而厌氧瓶生长细菌分类与数量,要学会导管相关感染的诊断,敏感性和特异性 检测管腔内的 & 外周细菌 不需要移走导管 可靠性和可重复性 易操作 快速回报 感染的微生物可以分离 对患者安全,关键点: 患者必须有菌血症症状,检测导管相关感染,移走导管 Maki Roll (半定量) 超声波降解和稀释 (定量) 通过管腔抽吸 (定量) 保留导管 管腔刷 定量培养 (CVC & 外周血) 达到阳性的时间 (CVC & 外周血),Maki 滚动法,导管尖阳性培养结果,两个血培养瓶必须同一时间抽取 CVC阳性报警时间(TTP)比外周血快 2 小时 短期插管 81% 敏感性 & 92% 特异性 长期插管 93% 敏感性 & 75% 特异性,阳性报警时间,Raad, I. et al. 2004. Ann. Int. Med. 140:18. 6138 份即时血培养; 191份两个血培养瓶中鉴定的细菌相同 (25份不同). 108 (1.8 %) 有导管相关性感染; 9.8% 仅仅只有CVC培养阳性.,脑脊液（CSF)培养 主要病原菌：B群溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌,最少1ml，最佳5ml,医生通过无菌皮肤穿刺采集脑脊液（腰椎穿刺）于无菌管中。第二管和第三管用于微生物学检测。,# 1,1500g离心15分钟（可能的话）,# 2,# 3,用吸管吸去 上清，留下 1cc的脑脊液沉淀,X,注意：不要倾倒,# 4,滴一滴沉淀 于巧克力平皿和 血平皿,上下吸取 10次以上 混匀沉淀,# 5,CO2孵育72小时/5天,# 6,将一大滴沉淀 滴在玻片上。 不要涂开。 自然干燥并进行革兰染色。 如见到大量多形核白细胞则 强烈支持感染,# 7, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,#1,#2,接种血平皿，麦康凯平皿，SS，若怀疑弧菌则还接种TCBS平皿。37 C 空气孵育48h,#3,粪便标本采集后30分钟内进行接种或置于cary-blair运输培养基中,#4,粪便培养 重要的病原菌：沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、产毒性大肠杆菌&难辨梭菌（在常规的实验室可能检测不出）,选择血性或脓性的部分进行接种,血平皿上氧化酶阳性的革兰阴性杆菌需进一步鉴定,麦康凯、SS平皿上不利用乳糖的革兰阴性杆菌需进一步鉴定。,氧化酶阳性、湿润的米色菌落,革兰染色显示弯曲或螺旋形的杆菌 弯曲杆菌属,#6, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,#5,将菌落接种分纯进一步鉴定,CO2孵育72h TM培养基上寻找淋球菌，血平皿上寻找酵母菌,# 2,血平皿& Thayer-Martin平皿,# 1,# 1,接种Thayer-Martin培养基&革兰染色,将拭子在玻片上滚动制成一个细胞厚度的涂片；寻找“线索细胞”,C. 怀孕35-37周的孕妇阴道或肛拭子,营养肉汤中 孵育过夜 血平皿上次代培养检测 B群链球菌,# 1,# 2,CO2中孵育48小时,D. 女性的阴道拭子,# 1,血平皿上寻找酵母菌， T-M培养基上寻找淋球菌,革兰染色辅助诊断细菌性阴道病,# 1,# 2,30 min内将拭子置于0.5ml生理盐水中检测滴虫,T-M培养基上的淋球菌,血平皿上的酵母菌,A. 女性的子宫颈或肛拭子,B. 男性的尿道拭子,生殖道标本培养 主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌&女性的细菌性阴道病综合征，孕妇携带的B群溶血链球菌, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,生殖道标本分泌物,使用拭子从阴道穹窿采集或使用自采集拭子。 拭子在玻片上滚动 如果可能，将阴道的分泌物直接涂抹在玻片上，如果太厚了，在玻片上涂开 床旁采集的标本最好,细菌性阴道炎的实验室诊断,1. pH 4.5,3. 稀薄的，均质的，灰白色的分泌物,4. 嗅探试验阳性,KOH 氢氧化钾,线索细胞,正常阴道内微生物-以培养为基础,乳酸杆菌,葡萄球菌,普雷沃菌属,消化链球菌,链球菌,产色素菌,肠杆菌,脲原体,95%,66%,52%,42%,38%,25%,25%,80%,支原体,14%,念珠菌阴道炎,1. 肠道内正常菌群 3. 引起瘙痒，凝乳块样白带 实验室诊断: 刮片或湿片 革兰氏染色 培养 VP确认,被阴道加德纳菌所覆盖的上皮细胞,结论: 细菌性阴道炎是一种生物膜疾病,用荧光探针染色的阴道加德纳菌,痰标本 主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。 非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌,病人需用水清洁口腔， 深咳肺部痰， 不要唾液,#1,进行革兰染色以评价标本是否适于接种。 向临床医生尽快报告重要的革兰染色结果,#2,#3,好：很少扁平 上皮细胞,CO2中孵育48小时,#4,接种巧克力平皿，血平皿和麦康凯平皿,#5,拒绝：大量 扁平 上皮细胞,肺炎克雷伯菌,对重要病原菌进行 鉴定&药敏试验,金黄色葡萄球菌,肺炎链球菌,胆汁溶菌, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,奥普托欣,流感嗜血杆菌,有意义的细菌浓度值（CFU/ml）,标本,有意义的浓度 CFU/ml,自然咳痰,107,诱导痰,不确定,气管内吸取物,106,支气管肺泡灌洗液,104,保护性毛刷,103,支气管灌洗液,不做培养,气管内吸取物,加等量的N-乙酰-L-半胱氨酸或溶痰剂,漩涡震荡30s,加0.01ml标本至1.0ml的TSB,每个平板涂0.01ml,血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,1：100稀释,1：2稀释,生长出50个菌落,支气管肺泡灌洗液,将所有标本装入50ml离心管内,离心20min，混匀10ml沉淀液， 漩涡震荡30s,每个平板涂0.01ml,血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,Use pipette. 用吸管吸取0.1ml至1mlTSB （1：10稀释）,生长出10个菌落,制作涂片（细胞离心),保护性毛刷,将毛刷置于1ml稀释液中,震荡30s,每个平板涂0.01ml,血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,生长出10个菌落,Use PRAS if anaerobic 若怀疑厌氧菌则使用PRAS,制作涂片（细胞离心),脓，吸取物或组织标本 主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓链球菌，其他溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其他革兰阴性杆菌。 非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌,用酒精消毒伤口 周围皮肤 最好的标本是吸取物和组织 最差的标本是拭子,#1,接种血平皿和麦康凯平皿 如果是吸取物或组织，进行革兰染色，将重要结果通知临床医生,#2,#3,铜绿假单 胞菌,中孵育48小时,#4,对1或2种 重要病原菌进行鉴定&药 敏试验,金黄色葡萄球菌为主,溶血链球菌,肺炎克 雷伯菌,混合的2种肠道革兰阴性 杆菌：2种均报告；,当检出3种或更多病原菌时，报告“混合菌群”并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠道革兰阴性杆菌等。, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,#5,咽部标本培养 主要病原菌：A群溶血链球菌。 选择性报告：溶血隐秘杆菌,拭子擦取咽部和扁桃体。不要碰触舌头和面颊。,将拭子擦拭血平皿（羊血或马血）的1/5区域,在第一区贴相邻的两纸片：复方磺胺和杆菌肽,# 1,拭子,# 2,在烛缸中37 C孵育过夜并检查 平板；若阴性，继续孵育 过夜 总孵育时间48小时,# 5,# 3,分区画线3或4区,接种环,溶血菌落， 0.5 mm, 对复方磺胺耐药，对杆菌肽敏感A群链球菌（触酶阴性）,# 6,杆菌肽 & SXT 纸片,# 4,杆菌肽,复方磺胺,PYR阳性可确证A群链球菌,# 7, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,不要报告 咽炎中非致病菌： 金黄色葡萄球菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 卡他莫拉菌 溶血链球菌 所有革兰阴性杆菌 所有酵母菌,报告结果： 1+ to 4+ A群溶血链球菌 或 1+ to 4+ 非A群溶血链球菌 或 未检出溶血链球菌,# 8,# 9,#1,#2,常规：接种沙氏平皿和Mycobiotic培养基。 30 C 空气孵育四周。 对于皮肤癣菌：接种Mycobiotic和DTM培养基 组织，皮肤刮取物或指甲：将一小块