色谱分析(浙江大学).ppt

色谱分析,Chromatographic Analysis,浙江大学化学系,色谱分析方法,2019/8/9,色谱分析-1,3,色谱分离方法：,2019/8/9,色谱分析-1,4,色谱法是一种分离方法，它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分配系数的微小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。,2019/8/9,色谱分析-1,5,色谱分析技术有广泛的应用领域,色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。,2019/8/9,色谱分析-1,6,石油化工,石油产品质量监控 油田开发（吸附丝技术）,2019/8/9,色谱分析-1,7,环保,污水检测 大气检测(室内和环境中空气质量监测、汽车内空气质量监测),2019/8/9,色谱分析-1,8,医药卫生,提纯净化如手性色谱分离有效成分 药物中间体的处理 食品卫生监测（瘦肉精、农残、抗生素）,2019/8/9,色谱分析-1,9,化学研究,样品提纯如合成产品的检验等 物质性质与其配比的相关性色谱法和化学计量学方法结合,2019/8/9,色谱分析-1,10,生命科学研究,DNA测序用CE、HPLC技术、 生物工程下游技术细胞的培养、分离、纯化和分析检测 参见 刘国诠主编 生物工程下游技术 化学工业出版社，1993年,2019/8/9,色谱分析-1,11,一、方法的发展,1952年，Martin和Synge首次用气体为流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱法。 1953年，Adams和Holmes合成了离子交换剂，并将其用于色谱分离，从而形成了离子交换色谱法。 1958年，Golay提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法,2019/8/9,色谱分析-1,12,一、方法的发展,1938年，Izmailov等将糊状氧化铝铺展在玻璃板上，形成2mm厚的薄层，用于分离药用植物的萃取物，开始了薄层色谱法。 1944年，Consden、Cordon和Martin创立了纸色谱法。他们利用滤纸的毛细作用，让溶剂由下至上地渗透，结合混合物中各组分在两相中的溶解度的差异，使各组分以不同速率在滤纸上迁移而得到分离,2019/8/9,色谱分析-1,13,一、方法的发展,1959年，Porath和Flodin提出了大小排阻色谱法，其原理是利用柱内多孔填料对不同尺寸的分子具有选择渗透作用。 80年代发展起来的毛细管电泳，解决了DNA及其片段、单克隆抗体、蛋白质及多肽等一般色谱技术难于解决的分离分析问题。现在已经派生出毛细管胶束电动色谱、毛细管等电聚焦、毛细管电泳离子分析法、微填充毛细管电泳法等多个新分支。,2019/8/9,色谱分析-1,14,二、仪器的发展,五十年代第一台色谱仪问世,2019/8/9,色谱分析-1,15,二、仪器的发展,六十年代就有数台5公斤重的色谱仪随阿波罗飞船同登月球，自动取样分析， 1970年更有一台100克重的色谱仪飞上了火星。,2019/8/9,色谱分析-1,16,二、仪器的发展,1967年时全世界共有色谱仪7万台 1972年就发展到20万台 现在我国的仪器就有数十万台 过去庞大的体积，到现在的越来越小巧 过去只有进口的，现在国产的也很好,2019/8/9,色谱分析-1,17,二、色谱法的特点,1分离效率高：可在很短的时间内分离多达二、三百个组分的复杂物质，柱效能可达106的理论板。 2检测能力强：可以检测出10-1110-15克级的痕量组分，能满足环境检测、农药残留等大量日常检测分析的需要。 3样品用量少：样品用量一般为微升级，少的可达纳克级。 4适用范围广：几乎所有与化学有关的领域都有其用武之地。,色谱分析-1,18,多模式及联用技术,复杂样品靠单一分离方法或技术是不够的，需多模式及多项新技术的联用。 极性溶剂提取物可考虑用HPLC 有挥发性的化合物优先用GC 毛细管电泳是HPLC的补充和发展 联用技术是今后的趋势 GC-MS LC-MS GC-MS-MS GC-FTIR,色谱基本理论,2019/8/9,色谱分析-1,20,三、色谱基本理论,2019/8/9,色谱分析-1,21,色谱分离原理,2019/8/9,色谱分析-1,22,基本关系式,保留时间 保留体积 容量因子k,2019/8/9,色谱分析-1,23,基本关系式,相对保留值,相对保留值是衡量分离情况的重要参数，大多数手册上可查到。因其只与色谱柱种类及柱温有关，故也是重要的定性指标。,2019/8/9,色谱分析-1,24,基本关系式,分离因子 塔板数 塔板高度,N和H都有理论值和有效值两类,其差别在于用保留时间和校正保留时间,2019/8/9,色谱分析-1,25,基本关系式（死时间测定）,死时间的测定很难： 无合适样品（完全不保留并有足够强的紫外信号） 一般测定方法为（紫外检测器）： 1. 正向四氟乙烯 反向苯甲酸、硝酸等 2. 比流动相少一个C的同系物 3. 不具备条件时可用下式计算,2019/8/9,色谱分析-1,26,基本关系式（分离度）,2019/8/9,色谱分析-1,27,基本关系式,2019/8/9,色谱分析-1,28,柱性能参数：,总孔率 柱压降 渗透率,2019/8/9,色谱分析-1,29,色谱理论塔板理论,塔板理论是由Martin等人在平衡色谱理论的基础上发展起来的。他们把色谱柱比拟为分馏塔，中间设想成可分为许多分馏塔片（板）。他们假定： 1流动相按前进方向以脉冲使通过柱子，最小单位为一塔板体积; 2. 组分在柱内两相间的分配系数是恒定的，与组分浓度及在柱内的位置无关; 3. 组分在所有塔板上的两相平衡在瞬间建立; 4. 所有组分浓度以起始塔板中的浓度为基准,2019/8/9,色谱分析-1,30,色谱理论塔板理论,由塔板理论可得到：在色谱过程中色谱峰是要展宽的，展宽的宽度平方值和理论板高H成正比。即相达成“平衡”所需的距离H值越大，则色谱峰展宽也就越严重。反之，若理论板高H值越小。而就一定柱长而言，组分在两相间的“平衡”次数就越多，色谱柱的分离效率就越高，因此理论板高H值是衡量色谱柱效率的一个很好的指标。 塔板理论回答了影响色谱峰保留时间和峰宽度这二个重要问题，但它没有回答宽度也就是相应的理论板高究竟受哪些操作条件的影响。,2019/8/9,色谱分析-1,31,色谱理论速率理论,1952年Lapidus等对填充柱色谱过程做了较详细的研究，指出色谱过程中引起组分宽度扩张的因素主要是： 1.沿柱流动方向的纵向扩散效应； 2.组分在两相间的平衡不能瞬时达成，即它在两相交换时传质速度是有限的。,2019/8/9,色谱分析-1,32,色谱理论速率理论,这就是著名的范底姆特方程。也可把Van Deemter方程描述为：,2019/8/9,色谱分析-1,33,色谱理论速率理论,与气相色谱不同，液相色谱有其特点，因而其速率理论的表述方式也有区别：,各项分别为：涡流扩散项、分子扩散项、传质阻力项（固定相、流动流动相和滞留流动相）,2019/8/9,色谱分析-1,34,色谱理论速率理论,各项可具体表述为：,2019/8/9,色谱分析-1,35,色谱理论速率理论,可图示为：,2019/8/9,色谱分析-1,36,色谱理论速率理论,最低板高： 最佳流速：,色谱参考资料,2019/8/9,色谱分析-1,38,专著,史坚编，现代柱色谱分析，上海科学技术文献出版社，1988.7. 达世禄编色谱学导论武汉大学出版社，1988.10. 周良模等编著，气相色谱新技术，科学出版社，1994.11. 卢佩章等色谱理论基础科学出版社，1989年第一版，1997年第二版.,专著,任惠敏主编的色谱技术丛书化学工业出版社，一套13本，涵盖所有色谱技术： 色谱分析概论 离子色谱方法及应用 色谱定性和定量 毛细管电泳技术及应用 气相色谱检测方法 色谱分析样品处理 液相色谱检测方法 色谱联用技术 气相色谱方法及应用 色谱柱技术 高效液相色谱方法及应用 色谱仪器维护与故障排除 平面色谱方法及应用,2019/8/9,色谱分析-1,40,杂志,色谱科学杂志（J，Chromatography Sci）1963年创刊,原名气相色谱杂志（J,Gas Chromat）,1969年改为现名,主要发表气相、液相原始论文和总结性文章（英文）和色谱标准图谱。 色谱杂志（J， Chromatograpy）1958年创刊,系多科性（包括气相、液相色谱，薄层色谱，纸色谱，离子交换色谱等）国际杂志，刊登各种原始论文及讲座性文章，并附有定性、定量数据及色谱文摘，文章以英文、法文或德文发表，从1993年起分A、B卷发行，每年还有Review专辑。,2019/8/9,色谱分析-1,41,杂志,色层法（Chromatographia），1968年创刊，多科性国际杂志，亦称色谱快报，文章以英文、法文、或德文发表，并附有三种文字的摘要。 Jouynal of Chromatography Library, 不定期出版。 液相色谱杂志（J, of Liquid Chromatography）, 1978年创刊,主要发表HPLC的研究报告。 高分离色谱与色谱通讯（J.of High Resolution Chromatography and Chromatography Communication）1978年创刊。,2019/8/9,色谱分析-1,42,杂志,色谱，1984年创刊，刊登各种原始论文和综述，为双月刊。 刊登色谱文章和评论性文章的还有各种分析化学相关的杂志，如各国的“分析化学”（中、美、英、日、德等），中文的理化检验、环境化学等专业文献上也有相当比例的色谱论文发表。,2019/8/9,色谱分析-1,43,手册,手册是最方便地查阅相关文献的工具，尽管所列数据并非最新的。 如1999年3月起再版的分析化学手册第二版，共10个分册： 1-基础知识与安全知识 2-化学分析 3-光谱分析 4-电分析化学 5-气相色谱分析 6-液相色谱分析 7-核磁共振波谱分析 8-热分析 9-质谱分析 10-化学计量学,2019/8/9,色谱分析-1,44,学术会议文集,每年都有不同组织者组织召开的国际国内的各种分析界的学术报告会，会议的文集也是一种很好的参考文献，值得收集阅读。 全国色谱学术报告会和浙江省色谱学术报告会均每两年举办一次，全国会议每次能征集到论文 500篇以上，省会议也能征集到60篇以上。,2019/8/9,色谱分析-1,45,色谱网站,已有很多国际网站，包括美国化学会的网站，可搜索后查取相关文献。 浙江省关于色谱方面的网站有： sepu .com 54,色谱柱系统,Chromatographic Column System,2019/8/9,色谱分析-1,47,色谱柱是色谱分析的心脏,色谱分析是分离方法，完成分离任务的色谱柱十分重要。 固定相柱内不移动、起分离作用的物质，有固体和液体之分。,2019/8/9,色谱分析-1,48,1 气固填充色谱柱,固定相为吸附剂，有以下特点： 较大的比表面大于200M2/克 较好的选择性 良好的稳定性 使用方便,2019/8/9,色谱分析-1,49,1.1 吸附等温线与峰形状,2019/8/9,色谱分析-1,50,1.2 传统固定相,活性炭(Activated Carbon)非极性，分析永久性气体 氧化铝(Alumina)中等极性，分析气体混合物 硅胶(Silica Gel)氢键型，分析小分子烷烃 分子筛(Molecular Sieves)强极性，永久性气体,2019/8/9,色谱分析-1,51,活性炭分离气体混合物,2019/8/9,色谱分析-1,52,氧化铝分离汽油,2019/8/9,色谱分析-1,53,分子筛分离永久性气体,2019/8/9,色谱分析-1,54,1.3传统固定相改性,针对各自的固有弱点而展开： 结构改性主要为扩大表面毛细孔径，使其比较均匀 化学改性除去表面的活性基团(-OH等) 氧化铝用不同浓度的KF改性作用不同 (填或扩)。,2019/8/9,色谱分析-1,55,2019/8/9,色谱分析-1,56,1.4 新型气固色谱固定相,石墨化炭黑(Cabopack系列，GCB系列)：加热使炭黑成片状石墨化结构，选择性提高，色谱峰形改善。 碳分子筛(TDX系列等)：是高分子产品，对-CH2-保留强。 多孔硅胶(Porasil系列等)：分离性能提高。 高分子多孔小球(Porapak, Chropmosorb等): 既是吸附剂又是载体，效果好。,2019/8/9,色谱分析-1,57,Poropak 固定相结构 苯乙烯-二乙烯苯共聚体小球,2019/8/9,色谱分析-1,58,碳分子筛分离含硫化合物,1.空气 2. 硫化氢 3. 氧硫化碳 4. 三氧化硫 5. 甲基硫醇 6. 二硫化碳,2019/8/9,色谱分析-1,59,上试402有机载体 (1)水 (2)甲酸 (3)乙酸 (4)丙酸 (5)丁酸 粒度：20/80目， 柱长：2米4mm， 柱温：160 载气：H2 25ml/分,2019/8/9,色谱分析-1,60,Poropak Q 测溶剂中水 1.6英尺英寸(0D)SS. Porapak Q(150-200目) TC=220, He 37ml/min, TCD,2019/8/9,色谱分析-1,61,2 气液填充色谱柱,在惰性固体表面涂渍高沸点有机化合物，以其特殊的性质进行分离。 惰性固体载体 有机化合物固定液,2019/8/9,色谱分析-1,62,1. 气液色谱载体,分为硅藻土和非硅藻土两大类，基本要求为： 表面积大，孔径均匀：承载更多固定液，并使液膜薄而均匀。 惰性好：能附着固定液且不和样品反应。 热稳定性和机械强度好：保证柱效 粒度均匀：便于填充,2019/8/9,色谱分析-1,63,1.1 硅藻土载体(Diatomite Suport),由具有一定气孔的单细胞海藻残骸堆积而成，因此硅藻土保持了海藻的多孔结构.,2019/8/9,色谱分析-1,64,1) 硅藻土载体性质,两种硅藻土载体的化学组成、内部结构基本相似，但表面结构大不相同，性能也不同。,2019/8/9,色谱分析-1,65,2) 载体吸附作用,载体表面具有硅醇（Si-OH）和硅醚（Si-O-Si）结构，且有少量金属（如铁、铝）氧化物（特别是红色载体），故表面存在着氢键和酸碱活性作用点，是引起载体吸附甚至化学反应或催化反应的根本原因。,2019/8/9,色谱分析-1,66,3) 吸附作用的消除,酸洗：目的是除去载体表面上铁等金属氧化物 碱洗：目的是除去载体表面Al2O3等酸性杂质 硅烷化：目的是消附载体表面的硅醇基团，减弱生成氢键作用力 。此法可拓展应用于特殊基团的引入 釉化：目的是堵塞载体表面的微孔和改变表面性质 加脱活剂：用表面活性剂饱和(键合)载体表面的吸附中心。,2019/8/9,色谱分析-1,67,2. 非硅藻土载体,有多种类型，主要有： 高分子小球：（如前述） 氟载体：可分析腐蚀性气体或强极性物质，但柱效不高，且装填困难。 玻璃微球：表面积小，渗透性好 ，但柱效低 。,2019/8/9,色谱分析-1,68,2019/8/9,色谱分析-1,69,2. 气液色谱固定液,为高分子有机化合物，在操作温度下必须呈液态，基本要求为： 对组分有良好的选择性 ：使样品中各组分能彼此分离 蒸气压低 ：减少色谱柱固定液的流失 热稳定性和润湿性好好：保证柱效 化学惰性好 ：不与组分、载体、载气发生不可逆的化学反应 凝固点低，粘度适当，成分稳定 ：,2019/8/9,色谱分析-1,70,2.1 分子间作用力,各组分之所以能在色谱柱中被分离，决定于分子间作用力的大小。 作用力大的保留值大，留柱时间长，后出峰。 主要有 色散力(非极性或弱极性分子之间的一种作用力 ) 诱导力 (极性分子与非极性分子之间使非极性分子极化而产生的力),2019/8/9,色谱分析-1,71,2.1 分子间作用力,定向力(极性分子间的永久偶极矩所引起分子间的一种作用力) 氢键作用力 (特殊的定向作用力) 选择性分子间作用力的研究有很好前景。其实是“超分子化学”理论的不同表述而已。,2019/8/9,色谱分析-1,72,1) 集团结构适应理论,在色谱分离中，有许多反常例子，出峰顺序与常规分子间作用力大小有违（20种典型化合物在12种固定相上201个相对保留数据中有66个与预测值不相符）。 由于分子中存在着各种集团，不同分子间的集团在电子性质及空间因素上各有不同。当它们互相适应时就能相互耦合，发生较强作用，宏观体现为后出峰。当它们不相适应时，虽有集团存在亦无这种加强作用。 换言之，分子间引力存在某种选择性。提出了选择性分子间引力理论，或称“集团结构适应理论”。,2019/8/9,色谱分析-1,73,2) 选择性分子间力,2019/8/9,色谱分析-1,74,2.2 固定液分类,按极性分：可根据被测物极性的大小来查阅，方便地寻找极性相似的固定液作替代品 按官能团分：便于了解固定液的类别，可由结构考虑来选择固定相,2019/8/9,色谱分析-1,75,A. 按极性分类的考虑,方法： 选3根柱子：,氧二丙腈，角鲨烷，待测柱 选两个评价物：苯环己烷测相对保留值 计算相对极性：,2019/8/9,色谱分析-1,76,按极性分类的考虑,计算相对极性 按20为一级分类,2019/8/9,色谱分析-1,77,B. 固定液特征常数概述,以不同性质的多种物质分别考察某固定液，将得到不同结果。将这些数据按一定的规律归类，并命名为特征常数。 由Rohrschneider于1966年首先提出，后由McReynods修正。,2019/8/9,色谱分析-1,78,1) 评价物及意义,2019/8/9,色谱分析-1,79,2) 两种评价体系的差异,罗氏评价物：在测定时需要用到气态烃类化合物，操作麻烦。麦氏正是针对该不足而提出，现广泛采用麦氏常数。 色谱手册上有该参数，有按5种评价物数值的大小排列的，也有以五项指标值之和（或平均值）排列的。,2019/8/9,色谱分析-1,80,3)部分固定液的McReynods常数值,2019/8/9,色谱分析-1,81,4) 特征常数的应用,判断固定液性质(极性大小、对哪类样品保留大)。 选择替代品(常数基本相同的便可替代)。 判断峰形好坏(在某固定相上已拖尾，则在常数值大的柱上拖尾将更严重)。 判断出峰顺序(常数值大的后出峰，且两数值之比大于1.5，可认为能很好分离)。 用于合理选择固定相(根据样品中不同组分的主要性质差异，合理选择相应参数差值大的固定液)。,2019/8/9,色谱分析-1,82,固定相的优选,固定相众多，实验室不可能也没必要配全。 推荐用固定相主要有：,2019/8/9,色谱分析-1,83,2019/8/9,色谱分析-1,84,键合固定相,以分子键的形式将固定液键合到适当的载体上，减少流失损失。 再适当胶联聚合，进一步提高性能，尤其是对毛细管柱。 主要的键和体系是以PEG系列为对象。 引入特殊基团可提高柱选择性(类似于具有选择作用的螯合树脂)。,2019/8/9,色谱分析-1,85,混合固定相,单一固定液不能满足分离需要时可考虑用混合柱。 混合模式： 混合涂 混合装 单柱串联 前两法的效果基本相近，较另一法好。,2019/8/9,色谱分析-1,86,混合固定相配比选择,可用窗口法求出合适的固定液比,2019/8/9,色谱分析-1,87,混合固定相配比选择,2019/8/9,色谱分析-1,88,程序柱,按预先设置的程序，按一定方式装填固定相而制成的柱子。 可改变的因素有：液载比、载体粒度、装填长度。 组合恰当，可得很好的分离效果。,2019/8/9,色谱分析-1,89,4) 固定液选用原则 “相似相溶原则”,被分离样品为非极性物质，一般选用非极性固定液。 被分离的样品为极性物质，则一般先用极性固定液。 被分离样品为极性物质（或易被极化物质）和非极性物质的混合物，一般也选用极性固定液,2019/8/9,色谱分析-1,90,4) 固定液选用原则,被分离的样品若为形成氢键的物质，一般选择极性或氢键型固定液 被分离样品为具有酸性和碱性（吡啶类）的极性物质，会产生严重拖尾，一般选用极性固定液，并加酸性或碱性减尾剂,2019/8/9,色谱分析-1,91,4) 固定液选用原则,被分离样品为异构体，一般选用强极性或有特殊作用力的固定液 被分离样品为不同族的混合物，视具体情况而定，或用单一固定液，或用混合物固定液。,2019/8/9,色谱分析-1,92,5) 固定液使用中的有关问题,A固定液的纯度和精制 固定液是一种高沸点的有机物，由于固定液的生产过程、包装、贮存和供应等方面的问题，有时会使得固定液中含有影响色谱分析的杂质，即达不到要求的纯度。如商品邻苯二甲酸酯和磷酸二甲酯中混有酸性化合物，聚酯和聚乙二醇等往往含有低聚物。因此，此类固定液在使用前必须予以精制。 目前常用固定液精制的方法有精密分馏和气相色谱分离纯化两种，后法简便、快速，得到的固定液纯度可达99.99%以上，但需用制备色谱仪，前法在实验室就可进行。,2019/8/9,色谱分析-1,93,B固定液的最高使用温度和最低使用温度,固定液虽是高沸点有机物，但也不能在太高的温度下使用。该限制温度即谓最高使用温度，它应比相应固定液的沸点低大约150200。超过最高使用温度可能使固定液变质，产生流失现象或者缩短色谱柱的寿命。 有的固定液使用温度有一个“下限”，即最低使用温度。低于此温度，固定液溶解被测组份的能力降低，或分离效果很差。如二甲基硅橡胶最低使用温度为100125、阿匹松L的最低使用温度为75、六环聚苯醚的最低使用温度为75等等。,2019/8/9,色谱分析-1,94,C. 固定液的涂渍与老化,色谱柱质量还与固定液能否均匀分布在载体表面以及填充情况有密切的关系。 当选好固定液后，还需要确定固定液与载体的量比(液载比，3:100到10:100)。 固定液一般采用动态法涂渍：涂渍须在通风柜进行。称取一定量固定液溶解在适当的有机溶剂中(必要时可回流)，然后加入一定量经过处理和筛分过的载体，在适当温度下轻轻拍打烧杯，待其中所有溶剂完全挥发后即涂渍完毕。,2019/8/9,色谱分析-1,95,C. 固定液的涂渍与老化,涂渍完毕还需进行老化处理，其目的有二：彻底除去填充物中的残余溶剂和某些挥发性杂质，促进固定液均匀牢固地分布于载体表面。 老化操作通常在较低的载气流速、略高于操作柱温，但又不超地固定液的最高使用温度的条件下，加热十几个小时，然后接入正常气路，直至记录器上的基线平直，就可进行分析。,2019/8/9,色谱分析-1,96,D. 色谱柱柱体的选择，试漏和清洗,填充色谱柱一般是玻璃柱或不锈钢柱(34mm14m)，根据实验条件(如柱压柱温)和样品性质(如反应性能、腐蚀性等)选择合适柱材，现多为螺旋形(螺旋直径与柱内径之比一般为15：1到25：1)。柱子使用前都需进行试漏和清洗。 试漏方法：将柱出口堵死后浸在水里，通气，在高于操作压力下，不应有气泡冒出。 柱的清洗与柱材有关：一般有碱洗、水洗、有机溶剂洗。,2019/8/9,色谱分析-1,97,E. 固定相的填充,一般采用泵抽法填充，在柱的一端（以后接检测器那端）填入少量玻璃棉后用布包紧，接上真空泵抽气，另一端用小漏斗加入固定相，在不断轻轻敲击柱身中直至填满。要注意的是，敲打不能过重，以免载体碎裂；对涂渍低沸点固定液的固定相不宜用泵抽法；装填要均匀，不要太松或太紧。,2019/8/9,色谱分析-1,98,F、其他柱子,现在多采用毛细管柱进行分离，它的处理以后专门论述。,2019/8/9,色谱分析-1,99,柱故障的诊断与排除 (1. 多出峰),有两种类型的附加峰 1. 即使不进样也会出现的峰 (鬼峰) ，并且在色谱分析过程中也会出现在真实的峰之中 2. 由样品产生的附加峰,2019/8/9,色谱分析-1,100,鬼峰,柱头污染 烘焙色谱柱，然后做空运行（无样品） 进样垫流失 使用高质量的产品 进样口污染 残留在进样口或衬管中的物质 载气不纯 使用高纯度的载气及高质量的气体净化器，并定期更换 载气中杂质与固定相发生反应 若使用分离/无分流进样口 进样口底部的密封垫可能会与样品反应 使用精制进口密封垫,2019/8/9,色谱分析-1,101,样品产生的附加峰,即使进纯样，也会出现附加峰 做一次空运行- 如果这些峰还存在，不是由样品产生的，按照前面介绍的方法检查 进样口温度过热，可以导致样品组分的降解 每次将进样口降低20， 观察峰是否仍出现 衬管与样品起反应 使用脱活的衬管 衬管内填充物有活性 更换衬管内填充物或使用无填充物的衬管,2019/8/9,色谱分析-1,102,样品产生的附加峰,样品在进样口停留的时间太长 增加柱流速 样品组分稳定性差 尽可能降低进样口温度 使用脉冲式无分流或脉冲式分流进样,2019/8/9,色谱分析-1,103,柱故障的诊断与排除 (2. 丢失峰),进样口温度太低 高沸点的化合物不能很快地气化 增加进样口温度 进样口温度太高 许多挥发性的组分在进样口降解 降低进样口温度 进样口被污染 进样口的污染物与样品发生反应 清洗进样口，更换衬管和进样垫 衬管有活性 使用脱活的衬管,色谱图中没有出现你希望得到的样品组分峰,2019/8/9,色谱分析-1,104,柱故障的诊断与排除,柱过载 将样品稀释10倍重新进样 使用较厚液膜但固定液相同的色谱柱 减少进样量 小体积进样 增加分流比 可能是几个未分离的色谱峰 将柱温降低20再进样 局部的分离可以显示其它额外的样品组分,峰型不好,2019/8/9,色谱分析-1,105,柱故障的诊断与排除,使用较长的色谱柱 试一试不同选择性或不同极性的柱子 如将HP-1换成HP-5 如将HP-5换成HP-35或HP-50+ 例如半挥发性的苯甲酸（色谱性能不好）,峰型不好,2019/8/9,色谱分析-1,106,柱故障的诊断与排除峰型很差,合并的峰（未分离的峰） 将柱温降低20-30 在进样口的底部安装柱子的地方安装绝缘帽 将进样口温度增加20-30 检查样品与溶剂的选择是否正确 对极性的化合物使用极性的溶剂,峰顶分叉（双肩峰）,106,2019/8/9,色谱分析-1,107,柱故障的诊断与排除峰型很差,检测器过载 减少进样量或将样品稀释10倍 或者使用较大的分流比 稀释样品可以达到较好的效果,峰顶分叉（双肩峰）,107,2019/8/9,色谱分析-1,108,色谱柱安装位置引起的问题,色谱柱到检测器安装位置不正确; 使其不能到达FID喷嘴 色谱柱到进样口安装位置不正确. 使其不能到达进样口 色谱柱到进样口及检测器的位置安装正确,108,2019/8/9,色谱分析-1,109,色谱柱安装到进样口 评定因素,安装深度 - 柱到针的间隙 按照厂方的介绍, 在进样针头到柱保留1-2厘米的间隙 对分析物和样品基质选择适用的衬管 使用专用的柱切割器 保证所有的柱接头及其它接口不漏,高效液相色谱法的相关情况,2019/8/9,色谱分析-1,111,液相色谱柱的保养,柱的稳定性与固定相类型及使用情况有关。如流动相中盐类的存在会使键合相柱的性能衰退；以SiO2为基质的固定相，过程随温度和pH(8)增加而加速。一根柱子使用是否得当，直接影响它的柱效和寿命。对于填装了粒度为10m以下的固定相的柱子，尤其如此。为了保持柱效、柱容量及渗透性，必须进行仔细地保养。是否会由于柱外效应，使分析柱的柱效明显下降？,2019/8/9,色谱分析-1,112,液相色谱柱的保养,1柱易被极细的颗粒堵塞，因此必须将流动相仔细地蒸馏、过滤。在流动相贮槽与柱之间，使用0.5m孔径的过滤器。水往往是一个重要的污染源。在水溶液流动相（如缓冲液）中，细菌容易生长，可能堵塞筛板。防止细菌生长的办法是加入抑制剂，如0.01%NaNO3。显然，抑制剂不能干扰分离和测定。,2019/8/9,色谱分析-1,113,液相色谱柱的保养,2在恒定压力下，发现流量减少，柱子可能部分堵塞。堵塞最容易发生在极窄的入口接头处以及入口、出口筛板处。堵塞后需要仔细拆洗，清除堵塞物，但必须防止较强的机械震动，防止用热手接触柱子，以扰动柱内的固定相层，使柱效发生变化。,2019/8/9,色谱分析-1,114,液相色谱柱的保养,3柱子的实际操作压力应低于填装时的最高压力，最好在最高压力的一半以下。实际操作压力过高，易使入口的固定相层下沉，形成一个空穴。若空穴形成，应重新装柱。在空穴中加入新的匀浆或玻璃微珠，也无法恢复到原来的柱效。 4应该用进样阀，而不用注射器进样，以防止注射隔膜碎屑集聚在柱入口。,2019/8/9,色谱分析-1,115,液相色谱柱的保养,5要防止反冲（流动相逆向流动），否则使固定相层位移，柱效下降。 6柱子两端用金属螺帽封闭，保存在纯净的有机溶剂中。应该将柱子保存在以下pH范围内的水溶液流动相中：2pH8.5。为了长期保存，最好用纯有机溶剂（如甲醇）清洗柱子。 7一定要防止柱子干涸，特别是硬胶柱。,2019/8/9,色谱分析-1,116,液相色谱柱的保养,8使用卫柱(Guard Column,亦称预柱)。连续注射含有强滞留(不被洗脱)组分的样品，将使柱效下降，保留值改变，选择性变坏，柱寿命缩短。为了延长柱寿命，在进样阀和分析柱之间加上卫柱。 卫柱较短(510cm)，固定相与分析柱类似。其作用是吸着强滞留的组分，防止对分析柱的污染，保持分析柱性能稳定。实验表明，只要卫柱与高效、小粒度分析柱联用，除了使k为零的组分的塔板数大大减少外，对k值较大的组分，其柱效下降很少。,2019/8/9,色谱分析-1,117,高效液相色谱的进样问题,液相色谱的进样系统，由于其柱压力高，不可能采用直接进样法，只能用进样阀进样。相对来说，进样方法较为简单，但两个效应是不可忽视的。,2019/8/9,色谱分析-1,118,1. 壁效应,采用通常进样方式时，样品和流动相一起加到柱入口。样品到达柱中心，不是呈一个浓度高度集中的规则的“点”，而是以不均匀的辐射方式分散在整个柱子的入口处。一部分样品很快到达柱壁区域。在柱壁区的谱带展宽尤为严重，且峰形不对称，甚至发生畸变，柱效明显下降。这种现象称为壁效应。,2019/8/9,色谱分析-1,119,1. 壁效应,2019/8/9,色谱分析-1,120,2. 无限直径效应,为了消除壁效应，可采用点进样（或称中心进样）技术，将样品导入柱头中心，而流动相直接穿过整个柱入口截面。这种进样方式把一个尖细的样品脉冲送到柱中心，在此样品脉冲向出口移动时，始终保持它的完整性，不接触柱壁。只要柱径足够大，加之组分在液体流动相中的径向展宽（从圆心沿半径向圆周的扩散）相当慢，使组分在扩散到管壁之前就已流出柱子。这种柱子称为“无限直径”柱。,2019/8/9,色谱分析-1,121,2. 无限直径效应,毛细管气相色谱分析,2019/8/9,色谱分析-1,123,一、毛细管柱与填充柱的区别,2019/8/9,色谱分析-1,124,2019/8/9,色谱分析-1,125,与填充柱相比，毛细管柱的特点为： 分离效能高 分析速度快 样品用量少 可在几十分钟内分离出包含几百种化合物的汽油馏分，然而样品用量仅有数微克 在快速分析方面，可在几秒钟内分离含十几个组份的样品。,2019/8/9,色谱分析-1,126,其独特的特点在于： 渗透性大，分析速度快 传质阻力小，可用长柱，并得高的总柱效。 色谱动力学认为：填充柱可看作是一束长毛细管的组合，其内径约等于粒子粒度，因其弯曲，多径扩散严重，故理论板数少。 毛细管柱完全没有这些缺陷，故理论板数可高大106数量级。,2019/8/9,色谱分析-1,127,用毛细管柱，有利于： 提高色谱分离能力， 加快色谱分析速度， 促进色谱的应用都是十分必要的：,2019/8/9,色谱分析-1,128,二、毛细管色谱法的相关理论,1毛细管柱的速率方程：,毛细管色谱理论和填充柱色谱理论基本相同，但各有特色，对操作条件选择有指导意义。其表达式为：,2019/8/9,色谱分析-1,129,填充柱：,毛细管柱：,2019/8/9,色谱分析-1,130,在毛细管柱，柱内只有一个流路，故多径项2dp为0，弯曲因子=1，且用其液膜厚代替了填充柱中载体的颗粒直径dp。,比较两式可得：,2019/8/9,色谱分析-1,131,2毛细管柱的最小理论板高,毛细管柱的HU图也是一个双曲线，在U值是最佳值时，H值最小。 式中Cg、C1的大小取决于分配系数及柱的几何性（以相比为代表），但一般毛细管柱液膜薄，值较大，液相传质阻力C1项不起控制作用。,2019/8/9,色谱分析-1,132,当被测物质的k10时，如果每米理论板数大于1000/d时，则所用柱子的性能较好,K值不同时的Hmin,2019/8/9,色谱分析-1,133,表中为K值很大时最好柱效(每米板数)值，其值由H/L = 1000 / d 一般认为直径在0.10.7mm较好 小于0.1mm，入口压力增加，柱负荷减少 大于0.7mm，虽柱负荷增大，但柱效下降 目前流行0.53mm的大口径管，不必分流。,2019/8/9,色谱分析-1,134,3载气线速,从速率方程可知，最小板高时的最佳线速为： 如果Cl很小，则有：,2019/8/9,色谱分析-1,135,可见，细管径，轻载气更适合于快速分析。,K=0 Uopt=6.9Dg/r K= Uopt=2.1Dg/r,2019/8/9,色谱分析-1,136,4样品容量,样品容量即允许进样量。每根柱有确定值 对毛细管柱，取决于色谱柱中固定液的含量。 进样量超过允许量后柱效降低，色谱峰展宽，出现不对称峰。,2019/8/9,色谱分析-1,137,一根色谱柱的最大允许进样量，约为一块理论板的有效体积。,可见最大允许进样量与柱半径、柱长、分配比成正比，与塔板数成反比,2019/8/9,色谱分析-1,138,2019/8/9,色谱分析-1,139,比较填充柱和毛细管柱的柱容量,一根长20米，内径为0.25毫米的毛细管柱，一般可涂上6 mg的固定液，柱内体积 而一根长两米，内径3毫米的不锈钢填充柱，柱内体积 按12：100的液载比，可涂上800mg固定液。 可见，一根2米长的填充柱中固定液的含量是一根20米长毛细管柱中固定液含量约150倍，故允许进样量也在一百倍以上。,2019/8/9,色谱分析-1,140,5、柱效能,毛细管柱每米塔片数通常在20005000之间，长20米的毛细管柱总柱效为4万至10万。 填充柱每米塔片数在10001500之间，长2米的填充柱的柱效为20003000 所以毛细管柱的总柱效可以比填充柱高10100倍。,2019/8/9,色谱分析-1,141,根据上式，分离度正比于总塔片数N。即 毛细管柱色谱总效高，其分离效能也高。 如果柱效高，K值也大是最理想的，目前流行大孔厚膜毛细管柱可望具有这两重性质。,2019/8/9,色谱分析-1,142,6、分析时间,根据公式,样品的保留时间正比于柱长，在以氮为载气时，毛细管柱的线速可达16厘米/秒，而填充柱在4厘米/秒 毛细管柱可采用很高的载气线速来缩短保留时间。且毛细管柱的K值比填充柱小，因此保留时间小。 故：毛细管柱上可实现快速分析。,2019/8/9,色谱分析-1,143,三、毛细管柱的色谱系统,与填充柱系统基本一样。 因毛细管柱内径细，柱容量小，出峰快、峰形窄，因此对色谱仪本身(如进样系统、检测器、记录器等)有些特殊的要求。,2019/8/9,色谱分析-1,144,1、进样系统,毛细管柱进样量必须极小（一般液样102103微升，气样约1微升）。 要引进如此微量样品，可采用分流法进样。即在气化室出口分两路，绝大部分放空，极小部分进柱子，这两部分比例叫分流比。分流法又分为动态法和静态法两种。,2019/8/9,色谱分析-1,145,对分流器的要求,为使分流后的样品不改变组成： 1、分流后样品混合物中各峰的相对大小应与未分流的严格一致。 2、分析不同浓度的混合物时，峰面积必须正比于浓度。 3、当柱温、分流比、流速改变时各色谱峰的相对大小要保持恒定。,2019/8/9,色谱分析-1,146,A动态分流法,是目前毛细管柱进样系统最常用的分流方法，不同仪器上的分流有不同的形式。,2019/8/9,色谱分析-1,147,1注射头；2进毛细管柱；3放空 AT形旁通管，B同心管，C反流T形旁通管，D改进同心管,2019/8/9,色谱分析-1,148,对分流器设计要求：,整个分流器要保持在气化室的温度下，防止样品冷凝； 分流前要有一定的混合体积，使试样、载气完全混匀， 放空管体积至少要等于样品气化后的体积加载气体积。,2019/8/9,色谱分析-1,149,A为气化样品与载气混合部分，B为分流点， C为喷嘴,引起放空部分与进入部分在分流过程中进一步混合，确保宽沸程样品分流后不失真。然后通过放空阀调节分流比。这种分流器只是在进样时才打开开关阀，几秒钟后就关闭大部分载气，而留下一点出气，防止试样反扩散进柱中。,2019/8/9,色谱分析-1,150,简易分流器,在一般填充柱气化室出口，并排插入两根同内径不同长度的不锈钢毛细管，垫上硅橡胶构成，其长度比即分流比。 注意 在分流前要有一段混合体积，内装硅烷化玻璃球，可保证分流后组成不失真。,2019/8/9,色谱分析-1,151,HP6820系统的分流装置,这是Agilent公司2003年推出的新型号仪器HP 6820的进样口装置。此为分流模式。 同时具有隔膜吹扫功能。,2019/8/9,色谱分析-1,152,HP6820系统的分流装置,此为不分流模式。通常适用于口径较大的毛细管柱，如0.53mm的大口径柱。,2019/8/9,色谱分析-1,153,2、尾吹,毛细管柱内流动相流速低，流量小，组分会因柱后死体积突然增加而发生严重的纵向扩散，从而导致峰形展宽，有可能使在柱中以分离的组分在柱后再次重叠，影响分离。 也可在使用FID时受阻于引入的H2压力而出柱困难。 增加尾吹气将改善这一状况。,2019/8/9,色谱分析-1,154,3、检测器,因流速低，且内径细，只能分析小量样品，约105106克，有的组份如占1.0%，则相当于107108克，要求高灵敏度检测器。 快速分析时因峰宽只有几秒或少于1秒，要求检测器、记录器响应时间快，则检测器和记录器的时间常数，应少于最早峰峰宽的流出时间的1/20。,2019/8/9,色谱分析-1,155,适用的检测器有：,高灵敏度的离子化检测器，常用FID。（灵敏度高，死体积趋近于零，响应时间快等。） 也可用氩离子化和电子捕获检测器，此时需在毛细管出口外加吹洗气以降低检测器死体积。 也可应用特制的微型热丝检测器，微型热敏电阻检测器，但因其属于非商品化检测器，使用频率不高。,2019/8/9,色谱分析-1,156,4、记录系统,因毛细管色谱峰很窄，应配备快速记录系统。 曾经用示波仪或电流计型记录器记录，其满刻度笔速0.1秒。 目前的各种色谱数据处理机和色谱工站已完全能满足记录系统的要求。,2019/8/9,色谱分析-1,157,5、 毛细管柱的种类,经典的毛细管柱为壁涂开管柱(WCOTWall Coated Open Tubular Column)。因其制备难、柱子的重复性差、内表面小、涂渍量小和值大，将导致有效塔板数和实际分离能力不高，且热稳定性也较差，故已几无人使用。其他的几种柱子及其性能如下。,2019/8/9,色谱分析-1,158,多孔层壁涂柱（PLOTPorous Layer Open Tubular Column）：先涂上吸附剂或惰性固体于柱壁，再涂渍固定液。 载体壁涂柱（SCOTSupport Coated Open Tubular Column）：把载体和固定液同时涂于壁上制备而成。 必须注意，以上两种柱子中的载体只是涂布于毛细管柱的壁上，而非充满整根柱子。 熔融石英毛细管柱(FSOTFused Silica Open Tubular Column) ：其表面惰性度好，能耐高温，最主要的是有弹性，不易折断。,2019/8/9,色谱分析-1,159,交联毛细管柱(CLOTCross-Linked Open Tubular Column)：涂好固定液后再用偶联剂交联键合，柱子性能有很大改善，能耐高温，抗水、抗溶剂。 大口径毛细管柱：一般口径在0.53毫米，液膜厚度为0.882.65微米，负载大，可不经分流而直接进样分析。 微型填充柱(Micro-packed Column)：制备过程和填充柱基本相似，只是所填的载体粒度很小。微填充柱宽有很高的柱效，最低板高可达0.20.3毫米。,2019/8/9,色谱分析-1,160,环境检测实例,用HP-WAX毛细管柱检测涂料溶剂，用程序升温模式可得到漂亮的谱图。,2019/8/9,色谱分析-1,161,海水中有机氯农药的残留量检测： 八个组分依次为：-HCH、-HCH、-HCH、-HCH、,-DDE、,-DDD、,-DDT、,-DDT,DB1701，30m0.32mm(id) 0.25m石英毛细管柱； 柱温：70保持1min，以15/min升至220，保持10min；,2019/8/9,色谱分析-1,162,高效感温型杀螨剂苯丁锡原药甲醇萃取物的GC-MS总离子流图 14:50的为双（2-甲基-2-苯基丙基）锡 23:62的为 二(2-甲基-2-苯基丙基)-叔丁基-氢化锡,HP-5色谱柱(30m0.32mm 0.25m) 柱温：503min 15/min24010min，,2019/8/9,色谱分析-1,163,栀子花头香成分 萜烯类化合物（如罗勒烯，香叶烯）共28种，占24.5；酯类化合物（如惕各酸酯类，苯甲酸酯类）共21种，占总挥发性化合物的13.6；醇类化合物（如芳樟醇，6-十一醇）共9种，其含量占44.7。,HP-5弹性石英毛细管柱(30m0.32mm0.25m)；柱温：40停2min，3/min升至110停2min,再以5/min升至200，保持10min,第三章 色谱流动相,Mobile Phase of Chromatography,2019/8/9,色谱分析-1,165,流动相的作用,色谱流动相决不仅仅是被分离物质的运载体，它直接影响到分离的好坏，也影响到测