蛋白质的检测和分离.ppt

第三章 蛋白质的分离 提纯及检测,第一节 引言 第二节 前处理 第三节 蛋白质的粗分离 第四节 蛋白质的层析分离 第五节 蛋白质的电泳分离 第六节 蛋白质的结晶 第七节 蛋白质的检测,第一节 引言,一、蛋白质的存在 蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 一般蛋白质，酶、抗体、激素蛋白、毒素蛋白等 存在部位 器官、组织、体液 胞内、胞外,一、蛋白质的存在,存在形式 游离状态 消化液中的蛋白 结合状态 蛋白与蛋白 蛋白与非蛋白,二、为什么要分离提纯蛋白质?,1、农业生产的需要 (1)对农副产品的综合利用需要高活性的酶制剂。 (2)用酶分析法测定家畜家禽以及农作物中某种物质的含量，需要用高纯度的酶制剂。,二、为什么要分离提纯蛋白质?,2、工业生产的需要 食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。 淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、葡萄糖异构酶,二、为什么要分离提纯蛋白质?,3、医疗上的需要 人尿激酶治疗脑血栓 用猪心细胞色素C治疗脑震荡心力衰竭 用猪胰岛素治疗糖尿病,二、为什么要分离提纯蛋白质?,4、蛋白质结构与功能研究及基因工程研究的需要 均一的蛋白制剂 工具酶 高纯度的标准蛋白,三、对蛋白质分离提纯的要求,1、纯度 决定于研究的目的和应用上的要求 2、活性 要求蛋白质保持天然构象状态，有高度的生物活性 3、收率 收率越高越好 提纯步骤愈多，则损失愈大 作为均一制剂，一般收率在5-20，最高可以达到50左右。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,准备工作： 1、选材，处理； 2、建立适当的细胞破碎和蛋白质抽提方法； 3、建立一系列的分离提纯和浓缩的方法； 4、建立灵敏而方便的分析方法，以估计每一个分离提纯步骤的提纯倍数和收率； 5、建立鉴定纯度的方法(如：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等)，以鉴定蛋白质制剂的纯度。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,蛋白质分离提纯的四个阶段： 第一阶段(前处理)： 选材，破碎，抽提，离心分离，得无细胞抽提液。胞外蛋白不须细胞破碎。 第二阶段(粗分级)： 根据不同蛋白质的溶解度差异，采用适当的沉淀法，对所需蛋白质进行初步的分离提纯。 如：盐析法、等电点法、有机溶剂沉淀法、选择性变性法，以及选择性沉淀法等。 适合于处理大量的样品溶液。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,第三阶段(细分级)： 经过粗分离得到的蛋白质制剂是不纯的 细分级可以采用适当的柱层析法。 如：离子交换柱层析(DEAE-纤维素、CM-纤维素)、分子筛层析(Sephadex)、吸附层析(羟基磷灰石)、疏水吸附层析、亲和层析、抗原抗体法等。 柱层析法对蛋白质的分离提纯效果很好，但不能处理大量的样品溶液 制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳，或蔗糖密度梯度等电聚焦法进一步提纯。 此二法只能处理少量样品，所以在提纯的后期使用，比较合适。 采用结晶法对蛋白质进一步提纯。 蛋白质制剂必须达到较高纯度才能进行结晶。所以，结晶法是在提纯的后期使用的。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,第四阶段(质量鉴定)：纯度、浓度 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、超离心沉降法、免疫电泳法、酶活力法、蛋白质化学结构分析法等。 一般需要用两种或更多的方法鉴定蛋白质制剂的纯度。 经常使用Folin-酚法，双缩脲法、紫外吸收法考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度。 酶需要测定比活力及酶溶液的蛋白质浓度。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,防止蛋白质变性的措施： 1、低温(0一4)操作，防止热变性和蛋白水解酶水解。 2、严格控制pH值，防止过酸过碱对蛋白质的变性作用。 3、搅拌要缓慢，防止泡沫表面张力引起蛋白质变性。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,防止蛋白质变性的措施： 4、防止蛋白质自发变性，可以采取下列措施： (1)加入低分子量物质(如蔗糖和甘油等)或加入纯化的蛋白质(如牛血清白蛋白、明胶等)，以提高蛋白质浓度，减少水的伤害。 (2)少数蛋白质必须在高离子强度的极性介质中才能保持活性，可以加KCI，或NaCl，(NH4)2SO4。 (3)有的蛋白质需要加入二价金属离子(如Mg2+、Ca2+等)才能保持稳定性。 (4)某些酶的提纯和保存，需要加入底物，才能稳定。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,需要额外注意的两个问题： 天然构象的保持 多亚基多功能寡聚酶,第二节 前处理,一、材料的选择 二、细胞破碎 三、抽提,第二节 前处理,一、材料的选择 选材的原则是： (1)材料中所需蛋白质的含量要高； (2)材料易得。,一、材料的选择,材料中蛋白质含量的多少与下列因素有关： 种属差异，如人与牛的同一种蛋白质，其含量常常相差十倍之多； 个体差异，在不同个体中，蛋白质含量也有明显的不同； 由于性别、年龄、季节、饲料条件的不同，蛋白质的含量也会发生变化。,一、材料的选择,从实验动物体内取材时，要注意三点： (1)要注意动物本身的生理特征； (2)要尽可能在接近正常状态下取出器官或组织； (3)死后的变化要限制在最小限度内，为此必须迅速取出器官或组织，充分脱血，立即使用，或放在-10-50的冷库中冻存。,二、细胞破碎,根据实验材料的性质，选择破碎方法 肝、脑、肾、脾等软组织，容易破碎，可以用匀浆器研磨； 肌肉不易破碎，可以先用绞肉机绞碎，然后用组织捣碎机粉碎； 红血球，其细胞膜脆弱，可以用低渗透压法破碎。 植物细胞，韦林氏捣切器、压榨机、石英砂研磨。 酵母和细菌细胞，可用法兰西压榨机(Frenchpress)、MantonGaulin匀浆器、振动研磨机、超声波破碎、反复冻融法。 化学法（去垢剂）、生物学方法（溶菌酶）。,二、细胞破碎,检查细胞的破碎程度的方法： (1)显微镜观察； (2)用分度管检查 将破碎细胞的悬浮液装于分度管中，离心3分钟，未碎的完整细胞首先沉降，在它上面是细胞碎片，再上面是细胞质部分。每一层的相对含量即表示细胞破碎程度。,三、抽提,抽提就是将破碎细胞中的蛋白质溶解在适当的溶剂中。 根据所需蛋白质溶解性，采用适当的溶剂抽提。 水溶性的清蛋白(如：血清白蛋白、卵清蛋白等)可以用水抽提； 不溶于水的盐溶性球蛋白(如：血红蛋白、肌红蛋白等)可以用稀中性盐溶液(如0.1MNaCl)抽提；,三、抽提,不溶于水和盐溶液但可溶于稀碱溶液的米谷蛋白和麦谷蛋白，可以用稀碱溶液抽提； 不溶于水和中性盐溶液，但能溶于7080乙醇溶液中的醇溶蛋白(如醇溶谷蛋白)，可以用7080乙醇溶液抽提； 脂蛋白要用表面活性剂(即洗涤剂)才能抽提出来， 膜蛋白往往用非离子型表面活性剂的稀溶液抽提。 不溶性蛋白，如角蛋白、胶原、丝心蛋白，可以用适当的溶剂洗去可溶物。,三、抽提,使用类似于生理条件下的缓冲液 2050mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.07.5) 0.1mol/L Tris-HCI(pH7.5) 含少量缓冲液的0.1mol/LKCl 必要时，可加入EDTA(15mmol/L)，巯基乙醇(3-20mmol/L)或蛋白质稳定剂等。,三、抽提,抽提的原则是：少量多次。,三、抽提,抽提过程中需要注意： 低温(0-4)抽提； 抽提蛋白水解酶时，须加入抑制剂； 如：以Ser为活性中心的酶，加二异丙基氟磷酸(DFP)，以巯基为活性中心的酶，加对氯汞苯甲酸(PCMB)。 抽提含有活性巯基的蛋白质时，要保护巯基 不要带入金属离子，可加入金属螯合剂，如EDTA； 不要带进氧化剂，可加入还原剂，如抗坏血酸等；,三、抽提,抽提过程中需要注意： 抽提带非共价键结合的配基的蛋白质时，要保护配基，不要使其丢失； 选择抽提条件时应考虑，尽量减少非蛋白质杂质被同时抽提出来； 如实验材料含有大量的脂肪，为了避免它干扰以后的分离提纯操作，须用有机溶剂(如：丙酮、石油醚)萃取，以去除脂肪。,三、抽提,抽提过程中需要注意： 防止植物组织中的多酚物质，氧化褐变，干扰蛋白质的分离提纯。 对植物组织使用较高浓度的缓冲液作为抽提液，防止植物细胞的内含物改变抽提液的pH值。 抽提外周膜蛋白时，必须用含有EDTA的适当缓冲液；抽提内嵌膜蛋白时，必须用去污剂作增溶剂。 可用高速离心法和过滤法(添加适当的助滤剂)使粗提液澄清。粗提液中如有大量核酸，可用核酸酶或用鱼精蛋白去除。,第三节 蛋白质的粗分离,根据蛋白质的溶解度差异分离 根据蛋白质分子大小的差异分离,盐析法,原理：是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素被去除沉淀。 优点：沉淀的蛋白质保持着它的天然构象，能再溶解。,一、根据蛋白质溶解性的差异分离,有机溶剂分级分离法,选择原则：与水完全混溶 不与蛋白质反应 有较好的沉淀效应 溶剂蒸气无毒、不易燃 原理：是将有机溶剂（丙酮、乙醇)加入蛋白质溶液中，导致溶液介电常数降低，增加了相反电荷之间的吸引力，蛋白质分子表面可解离基的离子化强度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。,有机溶剂,优点：比盐析法分辨率高，提纯效果好，生产中应用多。 注意事项：使用丙酮沉淀时，必须在04下进行。丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，防止变性。,3.有机聚合物沉淀法,水溶性中性高聚物 聚乙二醇（PEG） 聚丙烯酸碱性蛋白质,4.选择性变性沉淀法,极端条件 热、pH、有机溶剂 等电点沉淀 氯仿血红蛋白 免疫沉淀 抗原抗体特异结合形成不溶性复合物,透析,透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法 。只用于除盐类和小分子杂质,二、根据蛋白质分子大小的差异分离,2.超过滤：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质,加压,蛋白质溶液,半透膜,超滤液,支持膜的栅板,3.密度梯度离心：蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小，也决定于它的密度。若它在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的较快，每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度时，即停止不前。,第四节 蛋白质的层析分离,层析技术也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论。 以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、纸层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。,一、层析概述 二、离子交换层析 三、凝胶过滤层析 四、疏水层析 五、亲和层析 六、吸附层析 七、聚焦层析 八、高效液相层析,（一）层析的原理,层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。,一、层析概述,层析分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,（二）层析的分类,按固定相基质的形式： 柱层析、纸层析和薄层层析,根据流动相的形式： 液相层析、气相层析,凝胶过滤,原理,吸附层析,疏水层析,分配层析,亲和层析,离子交换,（三）层析前蛋白质处理,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。,（四）层析基本操作过程,上样均一性 洗脱装置,目的不同 检测方法不同 活性检测,基质均匀性 柱层析的L/d比值,1、柱层析的L/d比值,2、洗脱装置,不改变溶剂体系 依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱 缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。 改善：蠕动泵或恒流泵,维持流速恒定的简易装置,改变溶剂系统,分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。 缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。,改变溶剂系统,梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。 注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。,线性梯度洗脱装置,性能未知样品的蛋白质分离： 改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱,3、结果检测,活性检测 比活没有提高 目的蛋白与杂蛋白并没有分开 比活有所提高，但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象 测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性,结果保存 薄层层析&纸层析 照相保存 扫描仪转为图形 积分仪变成数据 柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理,4、层析装置的仪器化,HPLC,与微机、质谱等连用,二、离子交换层析 (ion exchange chromatography，IEX),（一）原理,离子交换层析(ion exchange chromatography，IEX) 技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 原理：利用蛋白质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。,惰性支持物(高分子聚合物基质) 解离基团(配基),共价结合,平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。 阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用 阴离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂，与带负电的离子基团发生交换作用,pH值的影响,离子溶度影响,离子浓度增加,离子取代顺序,（二）离子交换剂的基本类型,根据可供交换的离子性质： 阳离子交换剂 阴离子交换剂 按解离基团的解离pH值： 强酸型交换剂 强碱型交换剂 弱酸型交换剂 弱碱型交换剂,离子交换剂的基质,琼脂糖 离子交换剂,离子交换 交联葡聚糖,聚苯乙烯,离子交换 纤维素,1、离子交换纤维素,常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素） CM-纤维素（羧甲基纤维素）,优点： 开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，吸附容量大，通透性好，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。 亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。 回收率高,缺点： 交换剂膨胀,2、交联葡聚糖,优点：,不会引起被分离物质的变性或失活 非特异性吸附 交换容量大 同时具有分子筛效应,离子交换葡聚糖的选用：,一般根据蛋白质的分子量而定 中等分子量（30000-200000）一般选A50和C50 低分子量（30000）和高分子量（200000） 均宜选用A25和C25。,3、琼脂糖离子交换剂,优点：,对pH及温度的变化均较稳定，可在pH310和070范围内使用，改变离子强度或pH时，床体积变化不大 交换剂坚硬，颗粒呈微球型，分辨率高 流速快，吸附量大 特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离,4、聚苯乙烯,阴离子交换剂 Amberlite IRA & Dowex eg. Dowex4-100 阳离子交换剂 Amberlite IRC & Dowex,强阴离子交换剂,交联度为4%,颗粒度为50-100目,5、其他,聚乙烯醇 DEAE-Toyopearl & CM-Toyopearl 富羟基 高亲水性 兼性离子交换剂 基质上连有-丙氨酸、对氨基苯磺酸、精氨酸等偶极离子,（三）基本操作,1、离子交换剂的选择,配基的选择 取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。 一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。,基质的选择,颗粒大小,2、离子交换剂的处理,酸碱浸泡 进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。,膨化 将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。,水悬浮 去除杂质和细小颗粒,3、缓冲液的选择,离子强度和pH 保证各个待分离物质的稳定；使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定； 注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。 缓冲液不能干扰洗脱液的测定。,4、层析柱的选择,亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大 增加柱长为宜，使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加，柱的直径与高度的比以1：20左右为宜。,采用离子强度较大的梯度洗脱 选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动，如果柱细长，即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离峰过宽，降低分辨率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交换剂时，常用的柱高为1520cm。,5、上样,样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度 离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。 不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。 上样量要适当，不要超过柱的负荷能力，通常上样量为交换剂交换总量的1-5。,6、洗脱,洗脱液 改变溶液的pH或改变离子强度 当使用阴离子交换剂时，增加盐离子浓度，则降低pH值。 当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高pH值 亲和洗脱 目的蛋白与加入离子发生特异性相互作用而被置换 添加置换剂 能置换基质上所有蛋白质 洗脱方法 阶段洗脱和梯度洗脱,洗脱速度 洗脱速度通常要保持恒定 洗脱速度慢：分辨率高，但洗脱峰宽 洗脱速度快：洗脱峰窄，但分辨率下降,7、洗脱液的监测收集及组分鉴定,监测 用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收 收集 用分步收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集 鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等,8、离子交换剂的清洗、再生和保存,清洗 可溶于碱的污染物 0.1 mol/L NaOH洗涤 Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤 结合缓冲液洗涤 可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。 对于疏水性污染物 乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤 可以除去脂类和其他的疏水性物质。,清洗 金属污染物 EDTA饱和的10 mmol/L HCl（即pH=2）处理柱子 沉淀物杂质 去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤。,再生 对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。 酸碱交替浸泡：阳离子型交换剂最后用NaOH处理，阴离子型交换剂最后用HCl处理。 保存 处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02 %的叠氮钠，4C下保存。,（四）应用实例,阴离子交换层析 从人血浆中分离得到血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG),用DEAE-Sepharose CL-6B柱大量分级人血浆蛋白,阳离子交换层析 用CM纤维素分离鸡蛋清中的蛋白质组份,表 鸡蛋清中一些蛋白质用CM纤维素分离结果的分析,三、凝胶过滤层析 (exclusion chromatography),凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等，依据是多孔的载体对不同体积和不同形状分子的排阻能力的不同，从而对混合物进行分离。,优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好 缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差,（一）原理,凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。,大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱 小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱,1、体积参数,分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。 Kd(Ve-Vo)Vi,Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，因而洗脱速度最快。即该成分的Kd0。 VeVi+Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部, 因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。 Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的 增加而降低。 一般物质的Kd值是0Kd l。,洗脱行为可以有三种可能的情况:,Kd(Ve-Vo)Vi,2、影响分离效果的因素,流速 加样体积 样品浓度 离子强度, 流速,影响洗脱液流速的因素,洗脱液加在柱上的压力 为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。 凝胶交联度 凝胶颗粒大小,流速过低 样品横向扩散增大，峰变宽，分辨率降低，洗脱时间长 流速过高 洗脱峰重叠，柱压增大，分离效果变差 线性流速控制在210cm/h, 加样体积,体积过大 平台洗脱峰或相邻峰重叠 体积过小 目的蛋白收集量少、稀释倍数大、浓度低, 样品浓度,进样前，样品应高度浓缩，浓度为1020mg/ml 分组分离&脱盐除杂 适当提高样品浓度 分级分离&分析性实验 浓度低, 离子强度,可防止蛋白质与蛋白质之间或与凝胶介质之间的相互作用 常用盐溶液： 20-100mmol/L NaCl 浓度过高 引起凝胶柱床体积变化,（二）凝胶过滤层析的介质,葡聚糖系列 琼脂糖系列 聚丙烯酰胺系列 多孔硅胶,1、葡聚糖系列,以微生物产生的葡聚糖Dextran为原料 用环氧氯丙烷为交联剂，在碱性条件下交联而成商品的凝胶，称为Sephadex,葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性,2、琼脂糖系列,较常用的是Pharmacia和BioRad两家的产品，前者生产的称为Sepharose，后者的产品为BioGel A。 BioGel A 系列的产品有不同的颗粒度，有粗、中和细三档，它们的颗粒度分别为l50m300 m，80m150m和40m80m 。,3、聚丙烯酰胺系列,由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺混合物聚合得到的多孔性物质。 先制成丙烯基的衍生物，然后再用N，N-甲叉双丙烯酰胺交联，得到商品化的凝胶，产物也是固体粉末，用前先溶涨。 较常用的是Pharmacia和BioRad两家的产品，前者生产的称为Sephacryl ，后者的产品为BioGel P。,4、多孔硅胶,优点： 物理化学稳定性高，耐热耐压，使用寿命长 缺点： 柱效较低 、表面具有离子性，对蛋白质有吸附性、不能在强碱性环境中使用,刚性亲水性填料，具有一定直径的多孔网状结构的球状颗粒,（三）基本操作,凝胶的选择 凝胶柱的制备 上样 洗脱 凝胶柱的重复使用与保存,1、凝胶的选择,分组分离 根据样品中的大分子和小分子分配系数上的显著差异，将其分开。 可选用Sephadex G-25和G-50 小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。,分级分离 将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离。 选用分级范围较窄的凝胶，且中间值 接近于目的蛋白的分子量,凝胶颗粒大小的选择,2、凝胶柱的制备,用于分组分离 短而粗 L/D值10 用于分级分离 L/D值比较大 对很难分离的组分一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在15cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。,柱L/D值的选择,装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液充分溶胀。 凝胶柱填装后通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，以检测凝胶柱的均匀程度。,3、上样,分组分离 加样体积约为凝胶柱床体积的1025 分级分离 加样体积约为凝胶柱床体积的15,4、洗脱,水 分离不带电荷的中性物质 电解质溶液（酸、碱、盐的溶液 ） 分离带电基团的样品 水与有机溶剂的混合液（水-甲醇、水-乙醇、 水-丙酮） 用于吸附较强的组分,洗脱液,5、凝胶柱的重复使用与保存,当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可以加入新的样品，继续使用。 保存 液相中保存：于凝胶悬液中加入防腐剂或高压灭菌后 4保存。 在半收缩状态下保存：60%-70%酒精液洗冲，凝胶体积缩小后冷藏或常温保存。 干燥状态保存：长期不用，水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇 洗，干燥后常温保存。,（四）凝胶层析的应用,脱盐 分离提纯 测定高分子物质的分子量 高分子溶液的浓缩 蛋白质复性研究,1、脱盐,将高分子溶液中的低分子量杂质除去，这一操作称为脱盐。可以用凝胶层析法。 优点： 操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变性 适用的凝胶： SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6,对于盐浓度低时易沉淀的蛋白质：,2、分离提纯,凝胶过滤的载体可以根据它们的孔径分为很多种不同的规格。每种规格都有其特定的分级的范围，一旦超出分组范围，不论是其上限还是下限，即使分子量有大有小，但载体的排阻情况基本相同，就不能分离。 在凝胶过滤层析时，要根据所要纯化的样品的分子量选择所用的凝胶过滤的基质。,天花粉毒蛋白的凝胶过滤分离,3、测定高分子物质的分子量,测大于所用载体上限分子的洗脱体积,测小于下限的分子的洗脱体积,标定凝胶过滤柱的Vo,标定凝胶过滤柱的Vi,测定一系列已知分子量的标淮样品在柱上的洗脱体积Ve,以(Ve-Vi)(Vo-Vi)和1ogMw 作图,测得了待测分子量的样品的Ve,从标准曲线上可以求得未知样品的分子量,蓝色葡聚糖,氨基酸、有色盐类,以标准样品的分子量的1ogMw对Ve作图,or,洗脱液中蛋白质浓度,4、高分子溶液的浓缩,5、蛋白质复性研究,四、疏水层析 (hydrophobic chromatography，HIC),（一）原理,疏水作用层析（HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种层析方法。 疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。 影响疏水作用的因素： 蛋白质的疏水性、蛋白质的环境,（二）疏水基质,应用最广泛,良好的生物相容性和化学稳定性,（三）疏水配基,烷基链配基,芳基配基,高分子配基,柱： HiPrep 16/10 样品: 细胞色素C(1)，溶菌酶（2），核糖核酸酶（3）， 靡蛋白酶原（4）,（四）基本操作,平衡 Equilibration 上样 Sample application 洗杂 Washing 洗脱 Elution,Equilibration,1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution,Sample application,1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution,Washing out unbound material,1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution,1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution,Elution,Elution,1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution,1、层析柱的选择,柱床高度通常为515cm 对一个优化好的分离方案进行规模放大时，可保持柱高不变，增加柱的直径 粗柱子（内径为1.6 5.0cm）适合进行HIC层析。,2、缓冲液的选择,往平衡的缓冲液和样品中加入一种盐析盐，有利于固定化配基与蛋白质的相互作用。 随着盐浓度的提高，结合到固定化配基上的蛋白质量也相应提高 。 洗脱时，洗脱液离子强度逐渐降低。,最常用的盐： (NH4)2SO4 、Na2SO4 和NaCl,2、缓冲液的选择,随着pH的升高，疏水作用相应下降 由于pH升高时，带点基团增加，从而导致蛋白质的亲水性增加 在中性pH条件下与疏水相互作用介质不结合的蛋白质，在酸性pH条件下则能够结合,洗脱时，洗脱液pH逐渐升高。,3、蛋白质的洗脱,低浓度的水溶性乙醇、去污剂和具有盐溶作用的盐破坏水的结构、降低表面张力，从而削弱疏水相互作用。 乙醇或去污剂的非极性区与结合的蛋白质竞争疏水性配基，从而将蛋白质替代下来。,4、HIC柱的再生、清洁和贮存,轻度污染时 蒸馏水洗涤 污染物紧密结合时 6 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍洗涤起始缓冲液或贮存缓冲液洗涤 NaOH可用于溶解变性和沉淀的蛋白质及脂类 未使用的介质储存在封闭的容器中，在4-25的条件下保存 用过的介质应贮存在含有适当抑菌剂的溶液中，在4 8的条件下保存，不得冷冻,五、亲和层析 (affinity chromatography),（一）原理,亲和层析 利用生物大分子与其配体之间具有专一性亲和力而设计的层析技术。 亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原-抗体、酶-底物或抑制剂、激素-受体等，它们之间都能够专一而可逆的结合。,分离原理 通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 优点 提纯效率高 分离快速,（二）亲和层析用基质,具有较好的物理化学稳定性 能够和配体稳定的结合 结构为均匀的多孔网状结构 与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附,1、各类基质优缺点,2、基质的活化,溴化氰活化 环氧乙烷基活化,指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。,多种商品化的活化基质,（三）配体,与待分离的物质有适当的亲和力 与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性 与基质稳定的共价结合 自身应具有较好的稳定性,配体的分类,特异性配体 只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体 eg. 抗原和抗体、酶和它的抑制剂 通用性配体 特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体 eg. 凝集素可以结合各种糖蛋白,蛋白质亲和层析中的合适配体,（四）基本操作,选择适当的配体 将配体固定化到基质上 将目的蛋白混合液加样到基质上 除去非特异性结合的蛋白质 洗脱纯的目的蛋白,1、上样,层析柱较短，通常10cm 左右 样品液的浓度不宜过高 上样时流速比较慢 样品缓冲液中有一定的的离子强度 上样时选择适当较低的温度,2、洗脱,特异性洗脱 指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。 非特异性洗脱 指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。,特异性洗脱,优点： 特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。 可避免蛋白质变性 缺点： 较长的时间、较大的洗脱条件。 改善方法： 选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度,特异性洗脱,非特异性洗脱,与配体亲和力较小 连续大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱体积较大，待分离物质浓度较低。 配体结合较强时 适当的pH、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活性 与配体结合非常牢固时 使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性,3、吸附剂的再生和保存,再生 用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡 严重的不可逆吸附时，使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶 保存 加入0.01%的叠氮化钠，4C 下保存,五、亲和层析用于蛋白质分离的实例,免疫亲和层析 凝集素和糖蛋白亲和层析 含有辅酶的酶类的亲和层析 酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析 肝素为配体的亲和层析 染料配体亲和层析 金属螯合层析,六、吸附层析 (absorption chromatography),（一）原理,蛋白质分子通过各种次级键的作用能吸附在某些吸附剂上，根据不同蛋白质对固定相(吸附剂) 的吸附程度不同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现，经反复的吸附解吸再吸附再解吸的过程，达到分离目的。 无化学键引入，只存在相对较弱的氢键、范德华力和疏水作用力相互作用。,（二）吸附剂,水合磷酸钙 羟基磷灰石,（三）优点,操作方便 吸附剂易得、价格低廉 能分离离子交换层析和凝胶过滤不能分离的蛋白质,八、高效液相层析 （ High Performance Liquid Chromatography ，HPLC）,（一）原理,高效液相色谱法是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。 高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。 目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。,特点：,高压、高效、高速，高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,（二）流程及主要部件,1.流程,2.主要部件,(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,(2)梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,(3) 进样装置,流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：,(4) 液相色谱检测器,a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。,b. 光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,c. 示差折光检测器 （differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；,(5) 高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,（三）高效液相色谱的固定相,高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108 1.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。,固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。 1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。,2. 全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（510m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及衡量分析。,（四）液相色谱的流动相,1. 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2. 流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 乙腈、水、缓冲液。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,3. 流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)。,4.流动相的要求,由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂与检测器匹配。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。,（3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。 （4）化学稳定性好 （5）低粘度（粘度适中） 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等。,第五节 蛋白质的电泳分离,一、概述 二、PAGE凝胶电泳 三、SDS-PAGE凝胶电泳 四、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 五、双向电泳 六、毛细管电泳,电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。,一、概述,（一）概念,原则上按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。,一、概述,（二）分类,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质,（三）基本原理,电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。 电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。,一、概述,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。,丙烯酰胺,N, N-甲叉 双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,1. 聚丙烯酰胺凝胶的制备,聚丙烯酰胺凝胶聚合为自由基聚合，其催化体系有两种： 1）化学聚合 化学聚合的催化剂（引发剂）通常采用过硫酸铵（ammonium persulfate，Ap），此外还需要加速剂TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可促使过硫酸铵形成自由基： S2O82- 2SO4- 这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。,2）光聚合,光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。 （2）低温、低pH都会减慢聚合