项目一血液标本采集和血涂片制备.ppt

,临床检验基础 鹤壁职业技术学院 医学检验教研室,血液一般检验,临床检验者准入、获取专业技术资格考试的必考课程之一，该考试设置“基础知识”、“相关专业知识”、“专业知识”和“专业实践能力”四个科目，其中临检所占题量和分值约20%，位居各检验之首。,临床检验基础又称为实验诊断学，是通过实验室的各种检查方法，包括感官检查、理学检查、化学检查、显微镜检查以及自动化仪器检查，对离体的血液、体液、分泌物和排泄物、脱落细胞等标本进行化学、病原生物学、显微镜形态学的检查、分析，以获得有关病原、病理生理变化及脏器功能状态等实验资料，从而协助临床对疾病进行筛检、诊断和鉴别诊断。,临床检验基础的概念,自动化仪器检查:电子计算机技术、自动化检验仪器取代手工法。速度快、精度高、操作易、参数多、易质控、信息大等。,感官检查:直接观察标本：颜色、透明度、性状，有无凝块或寄生虫,临床检验的一般方法,理学检查:液体的相对密度、血液比粘度、红细胞沉降率、红细胞比积等病理变化,化学检查:定性或定量检测标本化学成分的病理变化,显微镜检查: 观察有形成分的数量和形态,手工法 自动化仪器法,现代临床检验的特点:检验操作的自动化、检验技术的现代化、检验方法的标准化、检验试剂的商品化、计量单位的国际化、质量管理的全程化,临床检验工作流程与质量控制,正确的标本采集和转运是降低结果差错率（可减少70%以上）的关键。标本采集原则：保持当时生理或病理状态下离体标本质和量的完整性。及时送检,临床检验在医学中的应用,1、为疾病诊断和鉴别诊断提供客观的实验室检查依据 发热、出血、贫血倾向的患者：血涂片检查到大量原幼红细胞可诊断为急性白血病。白细胞（中性粒细胞）数量增多、血沉增快：支持急性心肌梗死的诊断，可与心绞痛相鉴别。显微镜发现病原体是确诊感染性疾病的依据。,2、为疾病疗效监测和预后判断提供动态变化数据 尿蛋白检测：检测肾脏疾病患者的病情变化；网织红细胞计数：对贫血患者、进行发射治疗或化学治疗的患者骨髓造血功能判断具有实际可靠的指导作用。 3、为疾病预防提供检测依据 预防为主是基本方针，从标本中检测寄生虫，可对感染人群进行必要的治疗和隔离，防止疾病的传播和传染。,学习的基本要求,1.熟练掌握临检的基本理论。 （生理学、病理学基础，检验基本理论）,2.掌握检验的基本实验技能。 （标本的采集、规范操作、质量控制等）,3.熟悉检验方法学的评价。 （评估和选择灵敏度高、特异性强的检验方法，正确分析比较手工检验方法和仪器检验方法的优缺点）,4.熟悉检验项目的参考值和临床意义。 (记忆常用检验项目的参考值，以便结合临床，对检验结果进行有效的分析）,勤学苦练,重点：1.血标本采集方法和血涂片制备技术 2.抗凝剂的应用 难点：血细胞染色原理,项目一 血液标本采集和血涂片制备,一. 掌握血液标本的采集方法及注意事项。 二. 熟悉常用的血液抗凝剂种类及其应用。 三、掌握血涂片的制备与细胞染色原理。,血 液 组 成,概述,概述,血 液 理 化 性 质,1.血量：成人45L，占体重6%8% 2.颜色：动脉鲜红，氧合血红蛋白多 静脉暗红，还原血红蛋白多 3.PH：7.357.45，动脉稍高，静脉稍低 4.比密和渗透浓度：血液比密取决于血细胞比容和hb量：男：1.0551.063; 女：1.0501.060;血浆比密与其血浆蛋白质含量有关：1.0251.030；血细胞比密：1.090 血浆渗量（渗透压）= 290310mOsm/kg.H2O， 5.血液特性：悬浮稳定性；粘滞性；凝固性,概述,血 液 生 理 功 能,1.运输功能（基本功能） 2.协调功能（输送激素、酶类到各个脏器） 3.维护机体内环境稳定性（酸碱平衡、电解质代谢、体温恒定） 4.防御功能（白细胞、抗体、补体等）,任务一 血液标本的采集及抗凝,一、采血部位,毛细血管采血法,成人：左手无名指或中指指端内侧(WHO),婴幼儿：大拇趾,血液标本的采集,耳垂：,不宜使用,手指,适用于需血量少(0.1ml)的检查。,或 内外侧缘,足跟,严重烧伤患者：皮肤完整处,？,毛细血管采血法,血液标本的采集,二、器材与试剂：无菌一次性采血针、一次性微量吸管、消毒干棉球、无菌干棉球、小试管、75%乙醇、生理盐水等。,按摩：轻轻按摩采血部位，使其自然充血。 消毒：用75%乙醇消毒棉球消毒。,针刺：待酒精挥发干后，用左手拇指和食指 捏紧采血部位，右手持采血针，迅速刺入23mm。,拭血：待血自然流出后，无菌干棉球擦去第一滴血。 吸血：按需要依次采血采血完毕，用干棉球压住伤口片刻。 稀释：无菌干棉球擦净吸管外余液，将吸管伸入装有生理 盐水的试管底部，慢慢排除吸管内的血液，上清液清洗管内余血23次。将试管内的液体混匀。,三、操作步骤,毛细血管采血法,血液标本的采集,1、准备 2、按摩 3、消毒 4、针刺 5、拭血 6、吸血 7、稀释,四、注意事项,1.采血部位不能有冻疮、紫绀、水肿和炎症等。,2.消毒后，待酒精干后采血。,3.取血时切忌用力挤压。,4.进行多项检查时，采集标本的顺序依次为: PLT计数、RBC计数、Hb测定、WBC计数及分类、血型鉴定等。,毛细血管采血法,血液标本的采集,毛细血管采血法,血液标本的采集,五、方法学评价,1. 操作方便； 2. 每人的皮肤厚度不同，无法控制 采血刺入的深度； 3. 常需挤压诱导，导致组织液混入， 影响结果准确性； 4. 标本不能重复应用； 5. 取血量少(0.1ml)。,1.毛细血管采血时应注意些什么？ 2.选择题： 1）新生儿做血细胞计数，多用下列哪个部位采血 A.手背 B.耳垂 C.足跟 D.左手无名指 2）关于毛细血管采血法，下列正确的是 A.耳垂血的红细胞、白细胞、血细胞比容结果 均比静脉血低10%左右 B.手指采血时流出的第一滴血即可用于检查 C.婴儿宜用耳垂或手指采血 D.成人推荐用手指采血，因其检查结果比较恒定,复习思考题,一、采血部位,常用肘部静脉,也可手背或外踝静脉等。,二、器材与试剂,注射器、压脉带、垫枕、75%酒精、 碘酒、无菌棉签(球)等。,静脉采血法,血液标本的采集,用于需血量较多或全自动血液分析仪测定。,四、注意事项,1.防止标本溶血。 2.压脉带压迫时间不能过长。 3.切忌将注射器往静脉内推。,三、采血步骤,静脉采血法,血液标本的采集,毛细血管采血与静脉采血优缺点比较,血液标本的采集,优点：防溶血 防标本污染 防交叉感染 可多管采集,缺点：成本较高,血液标本的采集,一次性使用静脉采血针,瓶塞穿刺针套 （防止血液泄漏）,抗凝：用物理或化学的方法，去除或抑制某些凝血因子，阻止血液凝固。,概念,血液标本的抗凝,物理方法抗凝：脱纤维蛋白 将血液注入到有玻璃珠的器皿中，转动，纤维蛋白缠绕凝固在玻璃球上，从而防止血液凝固成块。适用于免疫学检验、红斑性狼疮细胞和细菌培养血培养基的制备。,常用抗凝剂：枸橼酸钠、草酸钠、二草酸盐、乙二胺四乙酸二钠（EDTA)、肝素,抗凝剂(anticoagulant)：能够阻止血液凝固的化学试剂或物质。,一.枸橼酸钠（柠檬酸钠）,适用项目：凝血象检查、红细胞沉降率、 血液保养液,常用的抗凝剂,血液标本的抗凝,抗凝原理：与血中钙离子结合形成螯合物,二.草酸钠,三.双草酸盐抗凝剂,抗凝原理：与钙离子形成草酸钙沉淀。,适用项目：血细胞比容、红细胞(计数）,草酸钾(钠)使RBC皱缩，草酸铵使RBC胀大。,常用的抗凝剂,血液标本的抗凝,不适于血小板计数和白细胞分类计数,四.乙二胺四乙酸（EDTA）盐,抗凝原理：与钙离子结合形成螯合物,适用项目：EDTA-K2用于血细胞计数(ICSH) 血细胞比容测定,常用的抗凝剂,血液标本的抗凝,不适于凝血象检查及血小板功能试验。,五.肝素,适用项目：红细胞渗透脆性试验、血细胞比容测定 血液流变学检查、多种生化分析,抗凝原理：加强抗凝血酶灭活丝氨酸蛋 白酶，从而阻止凝血酶形成、抑制血小板聚集。,不适于白细胞计数及分类计数,常用的抗凝剂,血液标本的抗凝,临床常用的采血试管,血液标本的抗凝,柠檬酸钠抗凝（抗凝比例1：9） 用于凝血象检查,加入促凝剂，用于普通生化检查,EDTA-K2抗凝，用于血常规检查,肝素钠抗凝，用于血流变学检查等,柠檬酸钠抗凝（抗凝比例1：4） 用于红细胞沉降率的测定,1.毛细血管采血时应注意些什么？ 2.常用的血液抗凝剂有哪些？ 3.选择题： 1）新生儿做血细胞计数，多用下列哪个部位采血 A.手背 B.耳垂 C.足跟 D.左手无名指 2）关于毛细血管采血法，下列正确的是 A.耳垂血的红细胞、白细胞、血细胞比容结果 均比静脉血低10%左右 B.手指采血时流出的第一滴血即可用于检查 C.婴儿宜用耳垂或手指采血,复习思考题,3）不与Ca2+作用,但能阻止血液凝固的抗凝剂是 A.草酸盐 B.EDTA-K2 C.肝素 D.枸橼酸钠 4）下列几种抗凝剂，哪种最适宜用于血细胞计数 A. 乙二胺四乙酸二钾(EDTAK2) B.枸橼酸钠 C.草酸钠 D.草酸钾 5）肝素作为抗凝剂,下列叙述错误的是 A.具有较强的抗凝能力 B.不影响血细胞体积 C.过量使用可引起白细胞聚集 D.适用于做白细胞分类计数,血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。 血涂片的用途：血细胞形态学检验、网织红、 寄生虫检验。,任务二 血涂片制备和细胞染色,一、手工推片法,将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。,图1-3 血涂片制备示意图（上：侧面观，下：正面观）,血涂片制备,推片,载玻片,血液,将推片匀速向前，勿停顿。涂片的厚薄取决于速度和角度：快、大(厚)。慢、小（薄）,一张满意的血涂片应厚薄均匀 头 体 尾鲜明,涂片干燥后用铅笔在血涂片的头 部写上姓名和编号,李四,B 1 2 3,血涂片的观察,低倍镜观察 1.染色情况(满意、偏酸、偏碱） 2. 细胞分布情况 油镜下分类计数：体尾交界处。 油镜分类时应按一定走向，不要重复计数。,李四123,适宜,不适宜,不适宜,二、血液涂片染色,对细胞核 着色较好,对细胞质 着色较好,瑞氏染料的组成：由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成的复合染料溶于甲醇制备而成。 碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，细胞核的染料。如亚甲蓝、天青。能结合酸性物质并染色，如淋巴细胞及嗜碱性粒细胞染成蓝色 酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。如伊红。能结合细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分等染成红色。,（一）瑞氏染色法,固定着色合并进行，简便，染色时间短，WBC特异性颗粒着色较好，细胞核着色较差。,细胞染色原理：,一般以它们的物理现象和/或化学现象为依 物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等 化学作用： a. 染料的化学成分：助色基团的存在，碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与组织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。,b. 蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同 数量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同时还有其 它活性基团。在游离状态时， -NH2获得一个H+变成 带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+变成带负电的-COO-。分别与不同染料结合。 c. 周围环境的酸碱度：如环境pHpI，则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之，pHpI，则结合碱性染料。,细胞染色法的类型,普通染色法： 经物理和/或化学作用的吸附、结合 荧光染色法：荧光染料，荧光显微镜 细胞活体染色法：活体染料如灿烂甲酚蓝等 细胞化学染色法：用化学反应显示细胞内某种成分 细胞免疫化学染色法（应用单克隆抗体技术、酶标记技术）,瑞氏染色法,瑞氏染料 由酸性染料伊红（eosin,E-）和碱性染料亚甲蓝(methylene blue,M+)组成的有机复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。将伊红和美蓝溶解在甲醇中，即瑞氏染料。,染色原理,细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，,例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性蛋白质，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。 M+Cl + Na+E ME + NaCl 美蓝 伊红 伊红化美蓝（瑞氏染料）,图1-4 瑞氏染色原理示意图,嗜碱性粒细胞,嗜碱性粒细胞,嗜多色性红细胞,中性粒细胞,嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞,试剂,Wright染液：瑞氏染粉0.1g, 甲醇60.0ml 甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态， 并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.4-6.8）：磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到1000ml。 配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。,染色方法,1. 用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。 2. 加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。 3. 滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。 4. 用清水冲洗，待干后镜检。,【质量控制】,血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落. 染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。 染液不能过少，以防蒸发沉淀。 冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料 沉着。冲洗时间也不能长。 染色过淡，可复染。 染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色.,中性杆状核粒细胞,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,姬姆萨染色法,原理 吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结 果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染1