糖尿病患者结合珠蛋白基因多态性与冠脉狭窄相关性研究.doc糖尿病患者结合珠蛋白基因多态性与冠脉狭窄相关性研究.doc

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糖尿病患者结合珠蛋白基因多态性与冠脉狭窄相关性研究潘巍巍1王云英2解丽艳1王述琦1赵琛1范茜1刘萍1于楠楠1张七一3作者单位1山东省青岛市市立医院干部保健科、2山东省青岛市市立医院中心实验室、3山东省青岛市市立医院心内科(266011)通讯作者潘巍巍1392150333QQCOM【摘要】目的探讨糖尿病患者结合珠蛋白基因多态性与冠状动脉狭窄严重程度的相关性。方法选择98例糖尿病合并冠心病患者以及77例单纯糖尿病患者,采用PCRSSP技术检测结合珠蛋白基因型,据此对糖尿病合并冠心病患者进行分组,采用GENSINI冠状动脉评分系统(GENSINI积分)对冠状动脉的狭窄程度进行评分。结果糖尿病合并冠心病组HP基因型分布与单纯糖尿病组相比差异有统计学意义,表现为HP22基因型在糖尿病合并冠心病组的频率明显高于单纯糖尿病组O.55VS0.35,P005。糖尿病合并冠心病组间,HP22基因型组的GENSINI积分明显高于HP11/HP12基因型组(P005)。结论HP22基因型可能与糖尿病患者冠心病的发生相关,且与糖尿病患者冠脉狭窄的严重程度相关。【关键词】糖尿病;结合珠蛋白HP;基因多态性;冠状动脉狭窄ASSOCIATIONBETWEENHAPTOGLOBINPOLYMORPHISMANDCORONARYARTERYSTENOSISINDIABETICPANWEIWEI,WANGYUNYING,XIELIYAN,ETALQINGDAOMUNICIPALHOSPITAL,SHANDONGQINGDAO266011,CHINA【ABSTRACT】OBJECTIVETOASSESSTHEASSOCIATIONOFHAPTOGLOBINHPPOLYMORPHISMANDITSRELATIONSHIPWITHCORONARYARTERYSTENOSISINDIABETICMETHODS98DIABETESMELLITUSDMWITHCORONARYHEARTDISEASECHDWEREENROLLEDINTHISSTUDYAND77SIMPLEDMWERESELECTEDASCONTROLTHEPCRSSPTECHNOLOGYISUSEDTOEXPLORETHEHPGENEANDPRODUCESDIFFERENTTEAMSTHEGENSINISCOREASSESSESTHESEVERITYOFCORONARYARTERYSTENOSISRESULTSTHEFREQUENCYOFHP22GENOTYPEISSIGNIFICANTLYHIGHERINDMWITHCHDGROUPTHANINSIMPLEDMGROUPO55VS035,P005ANDINDMWITHCHDGROUP,THEGENSINISCOREOFHP22GENOTYPEISHIGHERTHANHP11/HP12P005CONCLUSIONTHEHP22GENOTYPEMAYBEASSOCIATEDWITHCHDINDIABETICANDITISRELATEDTOTHECORONARYSTENOSISDEGREE【KEYWORDS】DIABETESMELLITUSDM;HAPTOGLOBINHP;GENEPOLYMORPHISM;CORONARYARTERYSTENOSIS糖尿病已经成为动脉粥样硬化和冠心病最重要的危险因子,氧化应激和炎症反应在动脉粥样硬化过程中扮有重要作用。研究显示动脉粥样硬化的发生与基因的多态性有关1。结合珠蛋白HAPTOGLOBIN,HP又称触珠蛋白,是一种酸性糖蛋白,属急性期反应蛋白之一,具有抗氧化活性,抑制前列腺素合成、促进血管生成及调节机体免疫等功能2。人类HP基因位于染色体16Q22.1,存在基因多态性,表现为三种基因型HP11,HP2L和HP223。国外研究发现HP22基因型是糖尿病患者心血管并发症出现的独立危险因子,HP22基因型的糖尿病患者更容易出现心血管并发症。本研究采用PCRSSP技术检测结合珠蛋白基因型,采用GENSINI积分对冠状动脉的狭窄程度进行评分,探讨糖尿病患者结合珠蛋白基因多态性与冠心病的发生及冠脉狭窄严重程度的相关性。1资料与方法11研究对象选取2010年5月至2011年1月青岛市市立医院西院心内科经过冠脉造影确诊的98例糖尿病合并冠心病患者,其中男性60例,女性38例,年龄47~77岁(平均5772995岁)以及同期经冠脉造影或冠脉CTA检查排除冠心病的77例单纯糖尿病患者,其中男性48例,女性29例,年龄48~76岁(平均58641014岁)。111糖尿病诊断标准①糖尿病症状+任意时间血糖水平≥11.1MMOL/L;或空腹血糖(FPG)水平≥7.0MMOL/L或口服葡萄糖耐量试验(OGTT)中,2H血糖水平≥11.1MMOL/L或有糖尿病史认定为有糖尿病。②如无症状需2次以上上述血糖水平检查异常。112采用JUDKINS法行选择性冠状动脉造影检查每支冠状动脉均经多体位投照。冠心病的诊断根据临床表现结合冠脉造影结果,至少一支冠脉血管狭窄大于50%确诊为冠心病。采用GENSINI冠状动脉评分系统(GENSINI积分)对冠状动脉的狭窄程度进行评分。根据受试者的冠脉造影结果,将冠脉分成14段,根据病变血管不同节段制定不同的权重系数,再根据冠脉管腔狭窄程度给以不同的权重系数,将狭窄程度权重系数乘以各病变血管的权重系数,最后总积分为各分支血管积分之和。狭窄程度以最严重处为标准狭窄直径≤25记1分,狭窄直径25一50记2分,狭窄直径51一75记4分,狭窄直径76一90记8分,狭窄直径91一99记16分,狭窄直径100记32分。病变血管不同节段权重系数左主干5,前降支近段25,前降支中段15,前降支远段1,回旋支近段25(开口处35),回旋支远段、钝缘支、右冠状动脉、后降支及第1对角支均1,第2对角支及后侧支05。113排除标准所有对象均做血常规、血生化、12导联心电图、X线胸片、心脏彩超,除外既往经皮腔内冠状动脉成形术或冠状动脉搭桥术、心衰病史、心脏瓣膜病、严重心律失常、结缔组织病、急性感染、恶性肿瘤、肝肾功能不全、严重创伤或重大手术。2周内服用过他汀类、非甾体类抗炎药、抗生素等能影响急性时相反应蛋白的药物的患者,均不能入选本研究。12HP基因型的检测采集受试者的静脉血2ML,EDTA抗凝,置于离心机内以1800RMP离心10分钟,分离出血浆。用天根公司提供的血液基因组DNA提取试剂盒提取受试者血液DNA。参考WERNERKOCH3对HP基因分型的PCR实验方法进行分型检测。用引物A和B扩增HP1特异性的1757BP片段,用引物C和D扩增HP2特异性的349BP片段。上游引物A5’GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG3’,下游引物B5’GAGATTTTTGAGCCCTGGCTGGT3’,上游引物C5’CCTGCCTCGTATTAACTGCACCAT3’,下游引物D5’CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT3’。PCR反应体系为模板DNA5UL,10TAPPLUSBUFFERWITHMGCL225UL,25MMDNTPMIXTURE2UL,10UM上下游引物各05UL,TAPPLUSDNA聚合酶25U/UL05UL,加入DDH2O补至25UL体系。扩增条件95℃预变性2分钟,95℃变性1分钟,69℃退火和延伸2分钟A和B扩增时或1分钟C和D扩增时,共35个循环后72℃终末延伸7分钟。PCR产物以1的琼脂糖凝胶电泳,经125V30分钟,在紫外光下观察,摄影。13统计学处理采用SPSS15.0统计软件分析。以均数标准差表示,计量资料组间比较采用独立样本T检验;计数资料采用卡方检验。所有统计学分析及双侧概率以P005表示差异有统计学意义。2结果21HP基因型分型结果,如图1所示条带1、3、5为引物A、B扩增产物,其中750BP经测序为B引物单独扩增序列,不影响结合珠蛋白基因分型,条带1、3含1757BP为HP1等位基因扩增产物;条带2、4、6为引物C、D扩增产物,条带4、6含349BP为HP2等位基因扩增产物。HP11基因型显示条带1、2;HP12基因型显示条带3、4;HP22基因型显示条带5、6。图1结合珠蛋白基因型电泳结果泳道1、2为HP11基因型,3、4为HP12基因型,5、6为HP22基因型。7为MARKER2000BP。22糖尿病合并冠心病组与单纯糖尿病组患者一般临床资料比较,性别、年龄、总胆固醇、低密度脂蛋白、糖化血红蛋白均无统计学差异(P005),见表1。表1糖尿病合并冠心病组与单纯糖尿病组一般临床资料比较1糖尿病合并冠心病组单纯糖尿病组P值N98N77性别(男性百分比)6122(60/98)623348/770172年龄(岁)5772995586410140183总胆固醇(MMOL/L)506059651205320790低密度脂蛋白(MMOL/L)296060228805840712糖化血红蛋白()752117766153082023糖尿病合并冠心病组与单纯糖尿病组间的HP22基因型出现频率分别为O.55VS0.35,P005,两组间HP基因型分布有统计学差异,表现为HP22基因型在糖尿病合并冠心病组的频率明显高于单纯糖尿病组。表2糖尿病合并冠心病组与单纯糖尿病组间HP22基因型频率比较糖尿病合并冠心病组单纯糖尿病组P值N98N77HP2254(055)27(035)0029HP1225(02630039HP11190192002624糖尿病合并冠心病组间,HP22基因型组的GENSINI积分明显高于HP11/HP12基因型组(P005)。表3糖尿病合并冠心病组不同基因型的GENSINI积分HP11/HP12HP22P值N44N54GENSINI积分57162543287723646000183讨论氧化应激和炎症反应在动脉粥样硬化过程中扮有重要作用,HP属炎性反应急性期反应蛋白之一,其主要功能是通过与游离血红蛋白结合形成HPHB复合物,并很快被单核.巨噬细胞系统介导的清道夫受体CDL63清除掉。一方面防止了过量HB对组织的氧化损伤,另一方面阻止了HB从肾小球滤过,避免了HB对肾小管的损害以及机体铁质的丢失。人类HP基因位于染色体16Q22.1,存在基因多态性,表现为三种基因型HP11,HP2L和HP22。心血管病的发病、预后是否与HP的基因型有关一直存有争议。国外很多大规模临床实验表明HP基因型虽与糖尿病的发病没有关系,但与糖尿病患者心血管并发症的出现有密切联系,HP22基因型是糖尿病患者心血管并发症出现的独立危险因子,HP22型糖尿病患者发生冠心病的机率是其它表型HP11和HP2L的25倍4。SULEIMANM等人对1437名发生心肌梗塞的患者发病三十天的死亡率和心衰率进行研究发现,HP22型糖尿病患者的心梗面积明显比较大,其心梗死亡率和心衰率是HP11型糖尿病患者的8倍5。我们的研究显示,HP22基因型频率在糖尿病合并冠心病组明显高于单纯糖尿病组O.55VS0.35,P005,在糖尿病合并冠心病组间,HP22基因型组的GENSINI积分明显高于HP11/HP12基因型组(P005),提示HP22基因型可能与糖尿病患者冠心病的发生相关,HP22基因型可能与糖尿病患者冠状动脉狭窄的严重程度相关。这个结果与上述的研究结果一致。可能机制为①不同基因型HP其结构不同,抗氧化剂活性不同,HP11基因型与其他型别相比具有更强的抗氧化活性6。②在糖尿病的病理状况下,HP的抗氧化能力被削弱,HP22基因型与HP11基因型个体间抗氧化应激的差别被进一步放大7,导致HP22基因型糖尿病患者体内的氧化应激状态普遍比HP11基因型的糖尿病患者高。ASLEH等8研究亦表明,HP与糖基化的HB结合后较与非糖基化的HB结合其抗氧化功能明显减弱,故可能使氧化修饰的低密度脂蛋白增加对动脉内膜造成损伤导致冠心病的发生。综上所述,HP22基因型可能与糖尿病患者冠心病的发生密切相关,可能与冠状动脉狭窄的严重程度相关。对于HP22型的糖尿病患者来说,适当地补充抗氧化剂例如维生素E,可以对抗心血管并发症的发生发展,根椐HP基因型对糖尿病合并冠心病患者开展个性化抗氧化治疗具有可行性。1段成城,徐力辛,陈倩。囊泡相关膜蛋白8基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病的相关性研究。中华医学遗传学杂志,2010.27329332。2LANGLOISMR,DELANGHEJR.BIOLOGICALANDCLINICALSIGNIFICANCEOFHAPTOGLOBINPOLYMORPHISMINHUMANS.CLINCHEM。1996,4215891600。3刘海波,施育平,郭小芳,等。结合珠蛋白基因1/2多态性与中国人冠心病易感性的关联研究J.中华医学遗传学杂志,2011,2816063。4LEVYAP,ROGUINA,HOCHBERGI,ETA1.HAPTOGLOBINPHENOTYPEANDVASCULARCOMPLICATIONSINPATIENTSWITHDIABETES.NENGLJMED,2000.34396970.5SULEIMANM,ARONSOND,LEVYNS,ETAL.HAPTOGLOBINITYPOLYMORPHISMPREDICTS30DAYMORTALITYANDHEAITFAILUREINPATIENTSWITHDIABETESANDACUTEMYOCARDIALINFARCTION.DIABETES,2005.54280228066TSENGCF,LINCC,HUANGHY,ETALANTIOXIDANTROLEOFHUMANHAPTOGLOBINJPROTEOMICS,2004;48222122287BAMMVV,TSEMAKHOVICHVA,SHAKLAIN.OXIDATIONOFLOWDENSITYLIPOPROTEINBYHEMOGLOBINHEMICHROMEINTJBIOCHEMCELLBIOL,2003.3534958.8ASLEHR,MARSGS,SHILKRUTM,ETALGENETIEALLYDETERMINEDHETEROGENEITYINHEMOGLOBINSCAVENGINGANDSUSCEPTIBILITYTODIABETICCARDIOVASCULARDISEASE.CIRC.RES.2003;9211931200
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