天然组织工程皮肤支架材料的分类及其免疫原性研究现状.doc

天然组织工程皮肤支架材料的分类及其免疫原性研究现状郑必祥彭代智陈博左海斌周灵周新刘敬基金项目国家高技术研究发展计划（863计划，2006AA02A121），国家重点基础研究发展计划（973计划，2005CB522605作者单位400038重庆，第三军医大学西南医院全军烧伤研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室通讯作者彭代智，EMAILDZPENGYAHOOCOM组织工程皮肤是组织工程研究最为成熟的一个领域，其核心内容是构建一种支持细胞生长的三维支架，与角质形成细胞和/或成纤维细胞进行体外复合培养，形成可用于创面覆盖与修复的皮肤等同物1。其中支架材料为种子细胞提供了黏附、迁移、增生和分化的空间环境，在组织工程皮肤的构建中起着重要作用。组织工程皮肤支架材料包括人工合成组织工程皮肤支架材料（简称人工合成支架材料）和天然组织工程皮肤支架材料（简称天然支架材料）两大类。人工合成支架材料主要包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸烷基酯及其共聚物等。人工合成支架材料始终无法模拟天然真皮的三维空间结构，其成分为人工合成，亲水性不够理想，缺乏细胞识别信号，与细胞间缺乏生物性相互作用，对细胞黏附力较弱2。而天然支架材料来源于天然组织，来源丰富，制作较为简单，造价低廉，且在三维结构、组织亲和性、机械性能及生物降解性等方面显著优于人工合成支架材料，从目前研究来看，是组织工程皮肤支架材料的研究热点3。但天然支架材料因来源和所含成分不同，存在着不同程度的免疫原性，限制了其临床的广泛应用。目前这方面的研究较多，因此，有必要结合天然支架材料的分类来概括其免疫原性研究现状。一、天然支架材料的分类按加工处理天然组织的方法分类，天然支架材料大致可以分为脱细胞支架材料和基质提取成分支架材料两大类。脱细胞支架材料是通过各种物理和化学的方法去除天然组织中的细胞成分，同时保留了原有组织的三维支架结构和主要细胞外基质成分的支架材料。目前应用较多的有脱细胞真皮基质（ACELLULARDERMALMATRIX,ADM）、脱细胞小肠黏膜下层（SMALLINTESTINALSUBMUCOSA,SIS）、脱细胞羊膜基质等。基质提取成分支架材料主要指通过从天然组织中提取某些成分，再构建出具有三维空间结构的支架材料。目前提取的天然细胞外基质成分主要有胶原类、壳聚糖类、透明质酸类等，由于单一成分合成的支架均有非常明显的缺点，因此，这类支架材料多以一种成分为主，多种成分组合构建而成，如胶原透明质酸复合支架、壳聚糖胶原复合支架、壳聚糖透明质酸复合支架、胶原硫酸软骨素复合支架以及胶原壳聚糖透明质酸复合支架等。1脱细胞支架材料（1）脱细胞真皮基质（ADM）ADM取材于人类皮肤或动物皮肤，通过物理和化学等手段，去除了细胞成分的同时保留了胶原纤维等细胞外基质成分和三维组织结构，具有良好的组织相容性4。美国LIFECELL公司推出的ALLODERM即是一种商品化的异体脱细胞真皮基质，临床应用效果良好5。由于异体ADM的存在来源有限的问题，近年来用异种皮肤来获得脱细胞真皮基质的报道亦较多6。由于大多数人认为猪皮与人体皮肤组织结构相似，并且具有来源广泛、价格低廉等优点，因此猪ADM成为研究热点7。但猪ADM在临床应用时存在营养渗透性差、血管化速度慢、移植皮片成活率低等不足8。最近，我们通过比较巴马小型猪与人真皮发现9，猪真皮不但三维结构致密，其主要成分也与人真皮相差甚远。因此，在选择ADM的来源动物时，有必要寻找真皮组织结构与人更为相似的动物。同时，由于现有ADM制作的方法都很难在降低免疫原性上达到满意效果，ADM的制备方法仍有待改进10。（2）脱细胞SIS脱细胞SIS是一种对小肠组织（通常来源于猪）进行脱细胞处理后所得的细胞外基质支架材料11。SIS中的胶原蛋白、蛋白多糖及糖蛋白构成的细胞外基质框架可作为组织形态发育、结构重建的天然生物支架，已成功作为多种组织工程的支架材料，用于如皮肤、血管、神经、肌腱等组织缺损的修复12。SIS有良好的生物相容性，植入体内后不引起明显的排斥反应，又具有适当的机械特性，能为成纤维细胞及新生血管的长入提供足够的生长空间，随着新生组织的形成，逐渐降解，产生的新生组织在结构和功能上均与原有组织相似13。（3）脱细胞羊膜基质羊膜是胎盘上最靠近胎儿的一种薄膜状组织，这种半透明薄膜由单层立方上皮细胞、较厚的基底膜以及一层无血管的间质组成14。羊膜的上皮细胞层含有羊膜上皮细胞和由羊膜上皮细胞分泌的多种生长因子，因此羊膜不仅具有生物支架所必须的基质结构，而且具有促进细胞生长的生物活性分子15。将羊膜中的细胞成分去除后所留下的无细胞结缔组织称为脱细胞羊膜或羊膜细胞外基质，具有免疫原性低的特点。何清义等16通过人羊膜细胞外基质与成纤维细胞的共培养，观察成纤维细胞的生长特性以及胶原纤维产生，提示成纤维细胞在支架上生长、黏附良好，胶原合成、分泌旺盛，认为人羊膜细胞外基质是一种较理想的成纤维细胞载体。2基质提取成分支架材料（1）以胶原成分为主的支架材料胶原是组织细胞外基质的重要组成部分。因其来源广泛，免疫原性低而被广泛地用作组织工程支架。胶原作为组织工程支架材料具有很多优越性，但胶原也存在加工性能差、缺乏柔韧性、抗拉强度低等缺点。为了改善胶原的力学性能，常常通过与其他成分进行组合，以调节其降解速度，增强力学特性。INTEGRA由戊二醛交联的牛Ⅰ型胶原与6硫酸软骨素构成，在其上覆盖硅橡胶薄膜。HEITLAND等17指出使用INTEGRA作为真皮替代物覆盖皮肤缺损部位，成纤维细胞黏附及生长良好，易于血管化，且不易降解，有一定临床应用价值。（2）含透明质酸类成分的支架材料透明质酸是一种蛋白多糖，是真皮细胞外基质的成分之一，具有良好的生物相容性和生物降解性。然而纯透明质酸具有易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等物理和生物特性，限制了它用于制备皮肤支架材料。因此，只有对透明质酸进行谨慎的化学修饰后才能用于制备皮肤支架材料。LIU等18将透明质酸与胶原/壳聚糖支架复合，体外观察显示复合透明质酸后的胶原/壳聚糖支架的柔韧性和降解性都有了较大的提高。在该支架上共同培养成纤维细胞和角质细胞2周后显示细胞沿支架成立体生长，形成细胞层，且出现基底膜含有典型的层黏连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白，说明可以通过胶原/壳聚糖/透明质酸支架在体外构建人工活性皮肤。（3）以壳聚糖类为主的支架材料壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，为一种天然聚阳离子多糖，在体内可被降解为易被人体吸收的氨基葡萄糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，是一种理想的细胞外基质材料。最近研究显示，壳聚糖及其衍生物由于其多孔凝胶结构，在体内与大分子物质的良好相容性等优势越来越成为一种很有发展前景的组织工程替代品，而利用壳聚糖制造的人工皮肤具有良好的组织相容性、成膜性、柔韧性和一定的抗菌消炎、促进伤口愈合的作用19。二、天然支架材料的免疫原性1脱细胞支架材料的免疫原性（1）ADM的免疫原性上世纪九十年代初CASTAGNOLI和SEDMALE发现同种异体皮肤移植所发生的免疫排斥反应主要源于角质形成细胞、朗格汉斯细胞和成纤维细胞等细胞。而在细胞中起主要作用的是由主要组织相容性复合物（MHC）决定的细胞膜上的糖蛋白抗原。根据这些糖蛋白的结构和功能不同，一般分为MHCⅠ和MHCⅡ两类。其中MHCⅠ类抗原分子主要作为自身抗原呈递细胞毒性T细胞，限制细胞毒杀伤作用。MHCⅡ类抗原在免疫反应中起调控作用，在辅助T细胞的激活中起作用。异体ADM由于去除了细胞，临床试验证实具有良好的术后远期效果且不发生明显的免疫排斥反应20。然而，现有的ADM制备过程中脱细胞时会有一定的细胞组分残余，这些残余有一定的免疫原性。例如，残余的DNA就是引起免疫排斥反应的因素之一21。近年研究发现，引起免疫反应的成分除上述细胞成分外，还应包含细胞外基质（EXTRACELLULARMATRIX,ECM）成分。ECM是一种主要由胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖以及弹性蛋白等组成的高亲水性大分子网络结构。ADM去除了细胞成分后保留了大部分的ECM成分，其免疫原性虽然大大降低，但仍存在排斥反应，说明ECM成分也具有免疫原性。由于异体ADM的材料来源问题，异种ADM引起人们关注。异种ADM由于种属问题，其免疫原性难以去除，移植后仍存在不同程度免疫排斥反应。常见的异种免疫排斥反应多与糖蛋白Α1,3半乳糖侧链Α1,3GALACTOSE,ΑGAL的末端这一抗原表位有关。由于人、猩猩和旧世纪猴体内的Α1,3半乳糖基转移酶（Α1,3GT）基因失活不存在这一表位22，所以，在非猩猩和旧世纪猴的异种移植中，人体就会产生抗GAL抗体占血液中IGG抗体的123，最终介导超急性和延迟排斥反应24。异种ADM的免疫原性分布存在着部位差异。有研究表明，真皮乳头层是异种抗原最易残留的区域，DESAGUN等25实验证实基底层IV型胶原或层黏连蛋白是猪ADM抗原的主要来源。XU等26在用ADM修复腹壁的动物实验中发现，异种ADM移植后，IGG、IGM等免疫球蛋白以及补体成分C5B在植入物的沉积部位主要集中在基底膜以及真皮乳头层。因此，根据脱细胞真皮基质的免疫原性分布特点，去除基底膜及致密的乳头层能降低免疫原性27。（2）脱细胞SIS的免疫原性脱细胞SIS与ADM类似，也是一种脱细胞后的基质，其植入体内也一般只引起以TH2淋巴细胞为主的一过性免疫反应，而TH2淋巴细胞不会激活巨噬细胞，产生的IGG不引起补体反应，因此不会引起显著免疫排斥反应。KIM等28将脱细胞SIS植入小鼠体内2周后观察发现，脱细胞SIS移植物内有大量宿主细胞植入并增生，周围无炎性反应细胞，说明脱细胞SIS不会引起急性排斥反应。但脱细胞SIS的长期植入是否会引起慢性排斥反应还有待研究。有学者就发现利用脱细胞SIS异种移植治疗人压力性尿失禁会引起患者局部炎性反应及疼痛等并发症29，其原因是脱细胞SIS引起的排斥反应，还是移植物太厚或移植局部血运不丰富导致局部组织缺血坏死，仍需要进一步研究。（3）脱细胞羊膜基质的免疫原性由于羊膜除了基质成分外，还含有多种生长因子，因此羊膜应用于临床时会使用新鲜羊膜及保存羊膜等未脱细胞的材料。由于含有细胞成分，移植时两种羊膜均会引起免疫排斥反应30。而脱细胞羊膜基质的主要成分是胶原蛋白等基质成分，与ADM和SIS一致，在没有细胞成分的前提下，所剩余的基质成分由于在不同种属间差异极小，免疫原性低，因此，移植后会有良好的组织相容性，不会引起明显的免疫排斥反应31。2基质提取成分支架材料的免疫原性基质提取成分支架材料一般为多种成分复合支架，其免疫原性体现为几种成分免疫原性的综合表现，因此，首先要明白其主要成分的免疫原性。（1）胶原的免疫原性胶原蛋白与其他许多蛋白质相比，其抗原性和免疫原性都很弱，因此长期被认为是安全的。但现今的免疫学分析和研究结果表明胶原仍存在着免疫原性。胶原蛋白的抗原决定簇大致可被分成3类。第一类是端肽。在2个不同种类的哺乳动物的胶原蛋白的非螺旋的末端区域中有很大的变化性，在这区域中几乎所有的氨基酸残基均表现出种属性变化。因此，大量的研究和目前的生产者都集中在如何完全去除端肽，认为去除端肽能降低胶原的免疫原性，PELNAC就是一种去除端肽的猪胶原蛋白海绵支架32。第二类是位于天然胶原蛋白的三螺旋结构内的抗原决定簇，其会在分离和纯化过程中暴露出来。第三类是指完整的三螺旋结构。尽管端肽是胶原的免疫原性的主要部位，但胶原的整个三螺旋也显示出一定的免疫原性33。（2）壳聚糖类的免疫原性壳聚糖具有活化巨噬细胞、诱导免疫调节因子的表达等功能，其结构中含有可衍生化的活性羟基氨基，正电荷密度高，有利于细胞的黏附，所以壳聚糖是一种良好的组织工程支架材料。壳聚糖及其衍生物具有良好的生物相容性，不与体液、组织和细胞产生明显的排斥反应，抗原性小。但是，壳多糖等多糖类支架材料缺乏细胞识别位点，不具备细胞行为的引导能力，所以，若在壳多糖类支架材料中引入细胞识别位点或与胶原复合，可增强其与特定细胞的相互作用，促进细胞发挥迁移、增生和特定基因表达的功能34。因此，壳多糖类支架在组织工程上的应用多以复合支架的形式出现。（3）透明质酸的免疫原性根据MEYER研究发现，透明质酸的结构主要由双糖体（DISACCHARIDE），乙酰氨基葡糖（NACETYLDGLUCOSAMINE）以及葡糖醛酸（DGLUCURONICACID），藉由Β13键连接而成。透明质酸在自然界中广泛地存在于脊椎动物的结缔组织、黏液组织、眼球的晶状体及某些细菌的荚膜中。但是，无论来源为何，透明质酸的化学组成及结构均相同。同时，透明质酸与其他的葡糖胺聚糖如软骨素和硫酸软骨素不同，它的结构中蛋白质或硫酸不是共价键结合，因此单纯的透明质酸无免疫原性，不会引起免疫反应35。单一的天然成分均无明显的免疫原性，但在复合支架的应用过程中也会引起一定的免疫反应，是合成过程中天然成分因改性而产生的新的构象造成，还是多种成分之间的化学键造成还有待进一步研究。三、展望天然组织工程皮肤支架材料通常来源于异种组织，无论是将其直接用于修复真皮缺损，还是用于构建组织工程皮肤，均有必要降低其免疫原性。因此，如何进一步降低其免疫原性仍是今后组织工程皮肤支架研究努力的方向。对于脱细胞支架材料而言，首先应在其动物来源上做好选择，使支架材料在免疫原性更低的同时，结构上也最接近于人真皮；其次应根据其免疫原性的组织学分布特点，着眼于制备方法的改进，利用新的手段降低其免疫原性。对于基质提取成分支架材料，在提取成分的来源组织选择上，应选择种属接近人的动物；在改变提取成分的性质时，应在不增加其免疫原性的前提下提高其组织亲和力和力学性能；而在多种成分组合时，应尽量避免产生新的抗原位点。在降低免疫原性的基础上，可引进活性成分进一步增加支架材料的生物活性，为种子细胞提供最佳的三维生存空间36。当然，从构建完美组织工程皮肤的角度考虑，组织工程皮肤支架材料应能促进表真皮连接的重建，便于皮肤附属器的生长，有利于血管与神经的再生37。参考文献1杨红明，柴家科，孙强皮肤组织工程材料在深度烧伤创面修复中的应用J/CD中华损伤与修复杂志电子版，2008，322332372HOMH,KUOPY,HSIEHHJ,ETALPREPARATIONOFPOROUSSCAFFOLDSBYUSINGFREEZEEXTRACTIONANDFREEZEGELATIONMETHODSJBIOMATERIALS,2004,2511291383HODDEJNATURALLYOCCURRINGSCAFFOLDSFORSOFTTISSUEREPAIRANDREGENERATIONJTISSUEENG,2002,822953084BADYLAKSF,FREYTESDO,GILBERTTWEXTRACELLULARMATRIXASABIOLOGICALSCAFFOLDMATERIALSTRUCTUREANDFUNCTIONJACTABIOMATER,2009,511135YIMH,CHOYS,SEOCH,ETALTHEUSEOFALLODERMONMAJORBURNPATIENTSALLODERMPREVENTSPOSTBURNJOINTCONTRACTUREJBURNS,2010,3633223286CHENRN,HOHO,TSAIYT,ETALPROCESSDEVELOPMENTOFANACELLULARDERMALMATRIXADMFORBIOMEDICALAPPLICATIONSJBIOMATERIALS,2004,2513267926867PRASERTSUNGI,KANOKPANONTS,BUNAPRASERTT,ETALDEVELOPMENTOFACELLULARDERMISFROMPORCINESKINUSINGPERIODICPRESSURIZEDTECHNIQUEJJBIOMEDMATERRESBAPPLBIOMATER,2008,8512102198姜笃银，陈璧，徐明达，等异种脱细胞真皮基质的制作和临床应用观察J中华烧伤杂志，2002，18115189郑必祥，彭代智，左海斌，等巴马小型猪与人真皮组织形态学和生物力学基本特征比较研究J第三军医大学学报，2010，32875475810杨燕妮，彭代智，伍素华，等异种无细胞真皮制备方法比较及在移植中的意义J中国临床康复，2004，8234772477311KROPPBP,CHENGEYBIOENGINEERINGORGANSUSINGSMALLINTESTINALSUBMUCOSASCAFFOLDSINVIVOTISSUEENGINEERINGTECHNOLOGYJJENDOUROL,2000,141596212ZHANGF,ZHUC,OSWALDT,ETALPORCINESMALLINTESTINALSUBMUCOSAASACARRIERFORSKINFLAPPREFABRICATIONJANNPLASTSURG,2003,51548849213CHENMK,BADYLAKSFSMALLBOWELTISSUEENGINEERINGUSINGSMALLINTESTINALSUBMUCOSAASASCAFFOLDJJSURGRES,2001,99235235814WANGMX,GRAYTB,PARKWC,ETALREDUCTIONINCORNEALHAZEANDAPOPTOSISBYAMNIOTICMEMBRANEMATRIXINEXCIMERLASERPHOTOABLATIONINRABBITSJJCATARACTREFRACTSURG,2001,27231031915NIKNEJADH,PEIROVIH,JORJANIM,ETALPROPERTIESOFTHEAMNIOTICMEMBRANEFORPOTENTIALUSEINTISSUEENGINEERINGJEURCELLMATER,2008,15889916何清义，李起鸿，许建中，等人羊膜与成纤维细胞的共培养在组织工程中的应用J中国临床康复，2004，881584158717HEITLANDA,PIATKOWSKIA,NOAHEM,ETALUPDATEONTHEUSEOFCOLLAGEN/GLYCOSAMINOGLYCATESKINSUBSTITUTESIXYEARSOFEXPERIENCESWITHARTIFICIALSKININ15GERMANBURNCENTERSJBURNS,2004,30547147518LIUH,YINY,YAOKCONSTRUCTIONOFCHITOSANGELATINHYALURONICACIDARTIFICIALSKININVITROJJBIOMATERAPPL,2007,21441343019KIMIY,SEOSJ,MOONHS,ETALCHITOSANANDITSDERIVATIVESFORTISSUEENGINEERINGAPPLICATIONSJBIOTECHNOLADV,2008,26112120CHENWF,BAROUNISD,KALIMUTHURANOVELCOSTSAVINGAPPROACHTOTHEUSEOFACELLULARDERMALMATRIXALLODERMINPOSTMASTECTOMYBREASTANDNIPPLERECONSTRUCTIONSJPLASTRECONSTRSURG,2010,125247948121GILBERTTW,FREUNDJM,BADYLAKSFQUANTIFICATIONOFDNAINBIOLOGICSCAFFOLDMATERIALSJJSURGRES,2009,152113513922GALILIUTHEΑGALEPITOPEANDTHEANTIGALANTIBODYINXENOTRANSPLANTATIONANDINCANCERIMMUNOTHERAPYJIMMUNOLOGYANDCELLBIOLOGY,2005,831267468623BADYLAKSF,GILBERTTWIMMUNERESPONSETOBIOLOGICSCAFFOLDMATERIALSJSEMINARSINIMMUNOLOGY,2008,20210911624KORENE,KUJUNDZICM,KOSCECM,ETALCYTOTOXICEFFECTSOFHUMANPREFORMEDANTIGALIGGANDCOMPLEMENTONCULTUREDPIGCELLSJTRANSPLANTPROC,1994,2631336133925DESAGUNEZ,BOTISJL,SRIVASTAA,ETALLONGTERMOUTCOMEOFXENOGENICDERMALMATRIXIMPLANTATIONINIMMUNOCOMPETENTRATSJJSURGRES,2001,9619610626XUH,WANH,SANDORM,ETALHOSTRESPONSETOHUMANACELLULARDERMALMATRIXTRANSPLANTATIONINAPRIMATEMODELOFABDOMINALWALLREPAIRJTISSUEENGPARTA,2008,14122009201927杨燕妮，彭代智，伍素华天然真皮支架抗原性研究进展J第三军医大学学报，2004，26242269227028KIMMS,AHNHH,SHINYN,ETALANINVIVOSTUDYOFTHEHOSTTISSUERESPONSETOSUBCUTANEOUSIMPLANTATIONOFPLGAAND/ORPORCINESMALLINTESTINALSUBMUCOSABASEDSCAFFOLDSJBIOMATERIALS,2007,28345137514329JONETT,AGGARMALN,SINGLAAK,ETALINTENSEINFLAMMATORYREACTIONWITHPORCINESMALLINTESTINESUBMCOSAPUBOVAGINALSLINGORTAPEFORSTRESSURINARYINCONTINENCEJUROLOGY,2008,7251036103930KUBOM,SONODAY,MURAMATSUR,ETALIMMUNOGENICITYOFHUMANAMNIOTICMEMBRANEINEXPERIMENTALXENOTRANSPLANTATIONJINVESTOPHTHAMOLVISSCI,2001,4271539154631WANGMX,GRAYTB,PARKWC,ETALREDUCTIONINCORNEALHAZEANDAPOPTOSISBYAMNIOTICMEMBRANEMATRIXINEXCIMERLASERPHOTOABLATIONINRABBITSJCATREFRACTSURG,2001,27231031932SUZUKIS,KAWAIK,ASHOORIF,ETALLONGTERMFOLLOWUPSTUDYOFARTIFICIALDERMISCOMPOSEDOFOUTERSILICONELAYERANDINNERCOLLAGENSPONGEJBRJPLASTSURG,2000,53865966633SHOULDERSMD,RAINESRTCOLLAGENSTRUCTUREANDSTABILITYJANNUREVBIOCHEM,2009,7892995834MAL,GAOC,MAOZ,ETALCOLLAGEN/CHITOSANPOROUSSCAFFOLDSWITHIMPROVEDBIOSTABILITYFORSKINTISSUEENGINEERINGJBIOMATERIALS,2003,24264833484135GOAKL,BENFIELDPHYALURONICACIDAREVIEWOFITSPHARMACOLOGYANDUSEASASURGICALAIDINOPHTHALMOLOGY,ANDITSTHERAPEUTICPOTENTIALINJOINTDISEASEANDWOUNDHEALIN