新城疫病毒抑制肝星状细胞活化的初步研究.doc

新城疫病毒抑制肝星状细胞活化的初步研究李亚琳渭南师范学院化学与生命科学学院陕西渭南714099摘要：目的探讨新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）在活化肝星状细胞（Hepaticstellatecell,HSC）中的复制对HSC的活化增殖以及细胞生物学功能的影响。方法用不同滴度的NDV溶瘤株Italien（NDV-Italien）感染经transforminggrowthfactor-1(TGF-1)刺激活化的人肝星状细胞系LX-2，MTT法检测NDV对细胞增殖率的影响。免疫荧光显微镜技术检测活化标志物-SMA的表达变化。结果NDV的感染抑制了LX-2细胞的增殖，细胞增殖率和病毒滴度呈负相关。与未刺激组相比，NDV在TGF-1刺激的LX-2细胞中的增殖抑制率提高，LX-2细胞的活化标志物-SMA的表达显著性下调。结论NDV在活化LX-2细胞中的复制具有抑制细胞增殖和HSC活化的作用。关键词：新城疫病毒；肝星状细胞；TGF-1ApreliminarystudyofNewcastlediseasevirusrepressingtheavtivationofhepaticstellatecellYalinLiCollegeofChemistryandLifeScience,WeinanTeacherUniversity,Weinan,Shaanxi,China,714099Abstract:AimToexploretheinfluenceofNDVreplicationonLX-2cellsonthecellviabilityandbehaviorofcellularbiology.MethodsTransforminggrowthfactor-1(TGF-1)-stimulatedLX-2cellswereinfectedbydifferenttitresofoncolyticNDV-Italien,theproliferationrateofLX-2cellswasdetectedbyMTTassay.Immunofluorescenttechniquewasusedtodetecttheexpressionofactivationmarkers-SMAinLX-2cells.ResultsNDVinfectioninLX-2cellsrepressedthecellproliferationinadose-dependentmanner.Comparedwithcontrol,thegrowthinhibitionrateofactivatedLX-2cellswasincreased,theexpressionofactivationmarkers-SMAofLX-2cellsweredown-regulateddramaticlly.ConclusionThereplicationofNDVinactivatedLX-2cellsrepressesthecellproliferationandattenuatedtheactivationofLX-2cells.Keywords:Newcastlediseasevirus；hepaticstellatecell；TGF-1基金项目：陕西省教育厅资助项目（新城疫病毒抑制肝星状细胞活化的体内外研究），（项目编号：009JK427）；渭南师范学院基金资助项目（新城疫病毒抑制小鼠肝纤维化的机制研究），（项目编号：10YKZ054）作者单位：714000陕西省渭南市，渭南师范学院作者简介:李亚琳，女，博士，副教授，主要从事肿瘤生物治疗研究Email：；通讯地址：陕西省渭南市朝阳路西段渭南师范学院化学与生命科学学院，联系电话：2133096，手机星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生的主要原因，而肝纤维化是肝癌前病变的重要病理阶段。免疫组化研究显示，肝癌合并肝硬化中活化的HSC数量显著增高，而肝癌细胞分泌的细胞因子也具有促进HSC活化并增殖的作用1；活化HSC和癌变细胞的相互作用会进一步加重肝癌合并肝硬化程度。因此着眼于活化HSC的靶向治疗是抑制肝纤维化，改善肝癌状况的一个新的研究热点。新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是单股负链RNA病毒，属副粘病毒科。由于多数RNA病毒具有天然地在肿瘤细胞选择性复制的特点，近年来用这类病毒作为新型运载工具在肿瘤基因治疗方面引起了人们的关注2，3。而我们前期的实验已经证明了NDV也能够在活化的HSC中复制。基于这个研究基础，本研究通过测定细胞增殖以及-SMA的表达，证明了NDV在活化的HSC中的复制对HSC的增殖以及活化标志蛋白-SMA的表达的抑制作用，从而为以肝星状细胞为靶点的肝癌合并肝纤维化治疗提供实验依据。1材料1.1细胞与病毒人肝星状细胞系LX-2，美国MountSinai医学院ScottL.Friedman教授馈赠；溶瘤株NDV-Italien由德国癌症研究中心VolkerSchirrmacher教授馈赠。1.2主要试剂DMEM培养基购于美国Hycolon；新生牛血清购于中国杭州四季青公司；重组人TGF-1购于以色列PeproTechAsia；鼠抗人-SMA一抗购于英国Abcam；羊抗鼠偶联AlexaFluor594IgG二抗购于美国Invitrogen。2方法2.1MTT检测NDV感染对LX-2细胞增殖的影响LX-2细胞以5103cells/孔接种在96孔板中培养24h,然后换以0.5%小牛血清的DMEM饥饿24h。然后用2ng/ml的TGF-1（W/V,用含2%NBCS的DMEM配制）刺激LX-2细胞24h，以不同滴度的NDV感染细胞，细胞培养24h后，MTT法检测NDV对细胞增殖的影响。2.2免疫荧光检测NDV感染后-SMA在LX-2细胞中的表达LX-2细胞以1105cells/孔接种在6孔板中（预铺盖玻片）。培养24h后，用NDV-Italien（1:400稀释）感染细胞。继续培养24h后，取出盖玻片，进行-SMA的免疫荧光检测，步骤如下：PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10min；0.1%的TritonX-100(用PBS配)渗透5min；PBST（含0.2%Tween-20的PBS）洗2次后，用5%的羊血清室温封闭20min；直接加入鼠抗人-SMA一抗（1:50稀释），37孵育1h；PBST洗3次后，加入偶联AlexaFluor594的羊抗鼠IgG二抗（1:800稀释），37避光孵育30min；PBST洗2次后，用DAPI(1:5,000稀释)染核2min；PBS洗3次，荧光显微镜观察-SMA在细胞中的表达。2.5统计分析数据用三个独立样本的均数标准差来表示(xs)，用独立t检验（independentStudentsst-test）来分析不同组之间的差异显著性，显著性界限定为P0.05（双尾）。所有结果通过SPSS统计学软件来完成。3结果3.1NDV抑制LX-2细胞的增殖LX-2细胞会随着传代培养而自发活化4。为了考查NDV对LX-2细胞的增殖影响，试验用不同稀释浓度的NDV-Italien感染传代到第5代的LX-2细胞以及用2ng/mlTGF-1刺激活化的LX-2细胞，并用MTT方法检测NDV对两组细胞增殖影响。如图1所示，LX-2细胞无论是在未刺激状态还是刺激后的活化状态，NDV均可以抑制细胞的增殖（A），且具有剂量依赖性。但是NDV对2ng/mlTGF-1刺激活化细胞的增殖抑制率更高（B），与未刺激组相比具有显著性差异（P0.05）。ThedilutionofNDVThedilutionofNDV图1NDV对LX-2细胞生长的抑制作用。LX-2细胞经2ng/mlTGF-1预刺激后，再用NDV-Italien感染24h。MTT检测细胞在490nm时的吸光度值（A），并计算细胞的生长抑制率（B）。数据为三次独立检测的平均值(xs)。Figure1TheproliferationofLX-2CellswasinhibitedbyNDV.LX-2cellswerepretreatedwith2ng/mlTGF-1,theninfectedwithNDV-Italienfor24h.CellproliferationwasdetectedusingMTTassayatwavelengthof490nm(A)andcellgrowthinhibitionratewascalculated(B).Datarepresentthemeansoftriplicate.3.2NDV抑制LX-2细胞的-SMA表达试验用NDV-Italien感染传代到第5代的LX-2细胞，免疫荧光法检测细胞中-SMA的表达。结果显示，在NDV感染前，LX-2细胞中有较强的-SMA表达（图2A）；而NDV感染后，细胞中-SMA的表达明显消失（图2B）。图2LX-2细胞中-SMA的表达。LX-2细胞接种在6孔板中培养24h，用NDV-Italien感染细胞。24h后，细胞被固定、渗透，羊血清封闭后加入鼠抗人-SMA一抗，37孵育1h。加入偶联AlexaFluor594的羊抗鼠IgG二抗，37孵育30min。用DAPI染核后，荧光显微镜观察-SMA的表达。NDV感染前（A）；NDV感染后（B）。（放大倍数400）Figure2Theexpressionof-SMAinLX-2cells.LX-2cellswereinoculatedin96-wellplatesandculturedfor24hfollowedbyinfectionwithNDV-Italien.After24h,thecellswerefixed,permeabilized,blockedbygoatserumandincubatedwithmouseanti-human-SMAantibodyat37for1h.ThensectionswereincubatedwithAlexaFlour594goatanti-mouseIgGsecondaryantibodyfor30minat37C.AfterstainedthenucleuswithDAPI,-SMAexpressionwerevisualizedunderafluorescencemicroscope.BeforeNDVinfection(A)；AfterNDVinfection(B).(Magnification400)4讨论活化HSC高表达-SMA，所以-SMA已经被用作判断HSC活化以及纤维化发展的标志5。而在HSC活化以及肝纤维化过程中，TGF-1无疑是一个重要的调节因子，是HSC活化的一个关键因素6。TGF-1能够促进HSC由星状的静止状态转型为成肌纤维细胞样的活化状态，诱导HSC活化并产生过量的ECM进而形成肝纤维化7,8。HSC活化以及肝纤维化的发生与肝癌发生也有密切的关系。国内几个报道均用免疫组化证明了肝癌组织中活化的HSC明显高于正常组织9,10；体外实验证明HSC在肝癌的血管生成中起主要作用11。有文献报道大鼠的肝癌细胞能促进HSC的募集和活化12；而肝脏损伤后病变的肝细胞也能诱导HSC的活化13。因此，肝癌发生发展过程中，活化的肝星状细胞和病变的肝细胞相互作用，共同促进肿瘤发生进程，而靶向HSC的抗纤维化治疗也成为阻止肝癌发生的有效途径之一14,15。我们以前的实验也证明了TGF-1具有促进HSC活化作用，并且用不同方法证实了NDV能够在活化LX-2细胞中高效复制。本试验通过进一步的研究工作探讨NDV在活化LX-2细胞中的复制对细胞的增殖以及活化功能的影响，证明了NDV在活化HSC中的复制能够抑制该细胞的增殖及活化，并降低细胞内一些活化相关基因的表达。MTT方法证明，LX-2细胞无论是否被TGF-1预刺激，NDV均剂量依赖性地抑制细胞的增殖。TGF-1刺激后，细胞在490nm的吸光度值和计算所得的生长抑制率总体高于未刺激组，说明TGF-1的刺激诱导了LX-2细胞的增殖，促进细胞的活化。而当NDV感染后，其在TGF-1刺激活化的LX-2细胞的复制率更高，从而对细胞生长抑制率也比为刺激组高。这个结果表明NDV更容易在刺激活化的细胞中复制而引起更高的细胞死亡率，即NDV的复制效率越高，对细胞的生长抑制率也越高，对细胞活化的抑制也更加有效。为了证明NDV的复制能够抑制HSC的活化，本试验检测了NDV感染对LX-2细胞中的-SMA表达的影响。同预期结果一样，NDV感染后-SMA表达明显消失。说明NDV的复制确实很大程度地降低了LX-2的活化程度。NDV能在活化HSC中相对高效地复制，进而抑制细胞的活化功能。以上实验数据表明：NDV在活化HSC中的复制，能够抑制HSC的增殖以及活化相关蛋白的表达，很大程度地抑制了HSC的活化功能。该结果为将NDV进一步用于抑制肝纤维化以及肝癌治疗提供一定的试验基础。参考文献：1NhieuJT,BrochriouI,PrauxAM,etal.Myofibroblastsandhepatocellularcarcinoma:aninvivoandinvitrostudyJ.JHepatol,1998,29:120-128.2BianH,FournierP,PeetersB,etal.Tumor-targetedgenetransferinvivoviarecombinantNewcastlediseasevirusmodifiedbyabispecificfusionproteinJ.IntJOncology,2005,27(9):377-384.3BianH,FournierP,MoormannR,etal.SelectivegenetransfertotumorcellsbyrecombinantNewcastleDiseaseVirusviaabispecificfusionproteinJ.IntJOncol,2005,26(3):431-439.4XuL,HuiAY,AlbanisE,etal.Humanhepaticstellatecellline,LX-1andLX-2:newtoolsforanalysishepaticfibrosisJ.Gut,2005,54:142-151.5AkpolatN,YahsiS,GodekmerdanA,etal.Thevalueof-SMAintheevaluationofhepaticfibrosisseverityinhepatitisBinfectionandcirrhosisdevelopment:ahistopathologicalandimmunohistochemicalstudyJ.Histopathology,2005,47:276-280.6ChangXM,ChangY,JiaA.Effectsofinterferon-alphaonexpressionofhepaticstellatecellandtransforminggrowthfactor-beta1andalpha-smoothmuscleactininratswithhepaticfibrosisJ.WorldJGastroenterol,2005,11:2634-2636.7BreitkopfK,GodoyP,CiuclanL,etal.TGF-/smadsignalingintheinjuredliverJ.ZGastroenterol,2006,44:57-66.8BreitkopfK,HaasS,WiercinskaE,etal.Anti-TGF-betastrategiesforthetreatmentofchronicliverdiseaseJ.AlcoholClinExpRes,2005,29:121S-31S.9吕丽,王莉芬,王丽丽,等.肝星状细胞、肝细胞生长因子与肝癌相关性研究J.肝脏,2005,10:213-214.10王伟,官阳,杨木兰,等.活化肝星状细胞与肝细胞肝癌发生及转移的相关性J.临床与实验病理学杂志,2007,23:492-494.11JungJO,GwakGY,LimYS,etal.Roleofhepatic