阻断孤啡肽受体对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用.doc

阻断孤啡肽受体对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用王高翔刘文博孙绪德姚立农柴伟摘要目的研究侧脑室给予孤啡肽受体阻断剂对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。方法雄性SD大鼠55只，随机分为假手术组（S组）、对照组(C组)和三个不同剂量的给药组（T0.03、T0.3、T3）。对照组和给药组都采用线栓法阻断大脑中动脉模型（MCAO），缺血2h后恢复再灌注。给药组分别于手术前45min右侧脑室给予孤啡肽受体阻断剂Nphe0.03nmol、0.3nmol、3nmol,体积10ul。S组和C组于手术前相同时间点侧脑室给予相同体积的生理盐水，其中S组给予与C组相同的手术操作但不置于尼龙线。每组大鼠随机分为两部分，其中8只在恢复再灌后24h行行为学评分,后断头取脑行TTC染色，计算脑梗死容积。3只在恢复再灌后24小时断头分离右侧海马组织，WesternBlot法分析caspase-3蛋白表达。结果与C组相比,T0.3和T3给药组的行为评分明显提高，T3组有显著性差异（P0.05）。T0.3、T3给药组的脑梗死容积明显减小，并有统计学差异（P0.05）。WesternBlot分析结果显示T0.3、T3组在缺血再灌后24小时caspase-3蛋白表达明显降低。结论阻断孤啡肽受体能剂量依赖性减轻脑缺血再灌注损伤，其机制可能与阻断神经元凋亡有关。关键词孤啡肽；孤啡肽受体；脑缺血再灌注；caspase-3TheprotectionoforphaninreceptorantagonistNphe1onfocalcerebralischemiainratsWanggao-xiang,1Liuwen-bo2,Sunxu-de1,Yaoli-long1,Chaiwei11,DepartmentofAnesthesia,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Tangduhospital.7100382,DepartmentofNurosurgey,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xijinghospital710032Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofintracerebroventricularadministrationofORL-1antaonistoncerebralischemia-reperfusioninjuryinrats.MethodsFifty-fivemaleSDratsweredividedrandomlyinto5groups:shamoperatedgroup(Sgroup)；controlgroup(Cgroup)；treatment0.03nmolgroup(T0.03)；treatment0.3nmolgroup(T0.3)andtreatment3nmolgroup(T3).Theanimalsincontrolgroupandtreatmentgroupswereexposedtothesuturemiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)modelandthereperfusionafter2hoursocclusion.TheanimalsintreatmentgroupswereintracerebroventricularlygivenORL-1antagonist(Nphe)45minutesbeforeMCAOsurgery,respectively.TheanimalsinShamandControlgroupsweregiventhesamevolumeofnormalsalineatthesamepoint，ShamandControlgroupsweregiventhesamesetofsurgicaloperation,butnot作者单位：710038西安市，第四军医大学唐都医院麻醉科（王高翔、孙绪德,、姚立农、柴伟）；第四军医大学神经外科（刘文博）责任作者柴伟修改placedinnylonline.Alltheanimalsineachgroupwererandomlydividedintotwoparts:eightofthemforbehavioralscoreandTTCstainingat24hoursafterMCAOsurgery；threeofthemfordetectingcaspase-3levelinrighthippocampusbyWestern-blotat24hoursafterMCAOsurgery.ResultsComparedwiththecontrolgroup,thebehaviorscoresinT0.3andT3groupsweremarkedlyincreasedwithhigherinT3group(P0.05).ThevolumeofcerebralinfarctioninT0.3andT3groupsweresignificantlydecreaseddose-dependently(P0.05).Western-blotanalysisrevealedthatadministrationof0.3nmoland3nmolNphe1significantlydecreasedthecaspase-3proteinexpressioninhippocampusaftercerebralischemia-reperfusion.ConclusionORL-1antagonistcanattenuatetheinjuryofcerebralischemia-reperfusiondose-dependently,anditsmechanismmaybeassociatedwithdecreasedneuronapoptosis.Keywords:orphanin；orphaninreceptor；cerebralischemia-reperfusion；caspase-3孤啡肽受体（opioidrecetor-like1receptor,ORL-1）是1995年1、2发现的一种新的阿片肽受体，参与机体许多生理功能及行为的调节，包括学习记忆、痛觉、嗅觉等多种感觉信号的整和以及运动功能的调控等。近年来研究发现，缺血后孤啡肽水平明显升高，并影响神经递质的释放以及缺血后脑血流3、4。在本实验中，我们观察了ORL-1的拮抗剂对脑缺血损伤后大鼠行为学变化和脑梗死容积的影响，并初步探讨其机制。材料和方法动物和试剂健康雄性4月龄SD大鼠55只，体重280-320g，随机分为五组：假手术组（S组）、对照组(C组)和三个不同剂量的给药组（T0.03、T0.3、T.3），每组11只。术前7天购自第四军医大学实验动物中心。饲养于20-25的室温环境中。自由进食、饮水。孤啡肽受体阻断剂（Nphe1NC（1-13）NH2，Nphe1，Sigma公司），利用生理盐水溶解，配成终浓度分别为0.03nmol/10ul、0.3nmol/10ul和3nmol/10ul，置于2-4冰箱保存待用。侧脑室给药大鼠术前禁食12h，不禁水。1戊巴比妥钠（50mg/Kg）麻醉后，水平固定于立体定向仪上。于Bregma点后0.8mm，矢状缝右侧1.5mm.用牙齿小钻定点上钻孔，微量进样器进针深度3.8mm。缓慢匀速推注药物，时间为10ul/10min，留针2min后退出进样器，缝合皮肤。局灶性缺血模型（MCAO）的制作侧注射完成后，根据Koizumi5等的方法，暴露右侧颈总、颈外及颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一尼龙线（3-0,EthiconInc,Japan）置于颈内动脉1718mm，阻闭大脑中动脉，缝合皮肤。120min后抽出尼龙线，恢复再灌注。术中动物体温维持在37-37.5。行为学评分动物完全苏醒后，将动物放回鼠笼，自由饮食。再灌注24h后由不了解分组情况的观察者根据Garcia6评分法评估并记录神经功能障碍评分（NDS）。该评分法最低为3分，最高为18分，评价内容包括运动功能和感觉功能。37分为重度神经功能障碍，811分为中度神经功能障碍，1218分为轻度神经功能障碍。脑梗死容积的计算和测量行为学评分完成后，断头处死动物，迅速取出鼠脑，置于冰盐水中10min，取冠状面均匀切成2mm厚脑片，放入20g/l的2，3，5-氯化三苯四唑（TTC，）溶液（37）中染色10min，然后用40g/l甲醛缓冲液固定。24h后用数码相机拍照，用图像处理软件（ADOBEPHOTOSHOP7.0）计算梗死面积（粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区）。为校正脑水肿带来梗死容积的偏差，用占对侧正常容积的百分比表示梗死容积。梗死容积=（对侧正常组织容积同侧正常组织容积）/对侧正常组织容积100%。Westernblot检测Caspase3的表达再灌注24h后，戊巴比妥钠麻醉随机抽取的3只大鼠立即处死取出全脑，在预冷至4的生理盐水中取出右侧海马组织，加入txl裂解液100ul,于冰盒中迅速、充分匀浆，12000g离心15min，收集上清液，100煮沸变性后上样行聚丙烯酰胺凝胶电泳(30g泳道)。电泳结束后，按程序进行转膜、一抗和二抗处理并进行ECL化学发光检测，压片曝光后进行图像处理分析。统计分析计量资料用均数标准差（xs）表示，采用单因素方差分析（ANOVO），多组间两两比较采用SNK（Student-Newman-Keuls）检验。神经功能学评分采用非参（Kruskal-Wallis）检验，若存在组间差异，以Mann-WhitneyU检验Bonferroni进行两两比较。结果缺血再灌注后24h神经功能学评分结果显示（见图1）：S组动物的NDS评分正常。C组和T0.03组大鼠NDS评分显著下降，二者之间未见明显差异，提示小剂量的孤啡肽受体阻断剂并不能减轻大鼠缺血再灌后神经元的损伤。T0.3组大鼠的NDS评分有所提高，但与C组比较差异无统计学意义。T3组大鼠的NDS评分较C组有明显的提高，差异有统计学意义（p0.05）。脑梗死容积的测量显示（见图2）：S组未见梗死，C组和T0.03组梗死面积明显高于T0.3组和T3组，组间比较差异有统计学意义（p0.05）。说明0.3nmol和3nmol的孤啡肽受体阻断剂能够减轻缺血再灌注后的神经元损伤，其中3nmol组的效果更为明显（p0.05）。Western-blot结果显示（图3）：C组大鼠海马组织Caspase3表达较Sham组显著升高，脑缺血再灌注24后给药之各组大鼠Caspase3表达与C组比较均显著受到抑制，但仍明显高于S组，这于NDS评分和脑梗死容积测量的结果比较一致。讨论孤啡肽受体（ORL-1）属于G蛋白偶联受体家族7。古航等8研究发现，宫内缺血缺氧新生鼠下丘脑及外周血中孤啡肽（orphanin-FQ，OFQ）含量均显著升高，如果缺血合并缺氧则会使OFQ的上升程度更高，恢复时间也相应延长9，Tekes.K等的研究认为体内OFQ水平升高可能假手术组和对照组做些什么动作与5-羟色胺能神经功能失调有关10。缺血后OFQ的升高对机体的影响尚未见报道。我们认为：脑缺血及缺血/再灌（I/R）所引起的OFQ升高会大量激活其内源性配基-ORL1受体，通过G蛋白偶联受体促发一系列的酶促级联反应，导致颅内环境的急剧改变，可能会进一步加剧缺血后的神经元损伤。因此，我们假定给予ORL-1的拮抗剂将对脑缺血损伤具有保护作用，减轻缺血后神经元细胞的损伤。Nphe1NC（1-13）NH2（简称Nphe1）是以能激活ORL-1最小片段NC（1-13）-NH2为模板，设计的孤啡肽受体竞争性拮抗剂，能明显的降低孤啡肽与其受体的亲和力，并且与其它阿片受体不发生交叉反应11，是目前研究孤啡肽和其受体的常用药物。我们在脑缺血之前45分钟通过脑室内给予不同剂量的Nphe1,发现给予0.3nmol和3nmol的Nphe1能显著提高脑缺血再灌注后大鼠的神经功能学评分，并明显减小脑梗死容积,并且呈剂量依赖性。以上结果表明阻断ORL-1能够减轻脑缺血后的神经元损伤。Caspase（半胱氨酸需要的天冬氨酸蛋白酶）是一个蛋白酶家族，媒介细胞死亡，是细胞凋亡过程中的“最后通道”；其中Caspase-3是细胞凋亡过程的重要下游分子，可以造成许多关键蛋白的裂解，因而被认为是一种效应Caspase12。其表达量的多少可以作为细胞凋亡程度的指标。所以我们利用western-blot检测大鼠脑缺血后24h时caspase-3在缺血侧海马的表达水平。实验结果显示，一定剂量的孤啡肽受体阻断剂能降低缺血侧海马Caspase-3蛋白的表达。此结果提示，ORL-1在脑缺血损伤中的作用可能是通过其下游的效应分子或蛋白促进细胞凋亡，加重缺血后的脑神经元损伤。脑缺血/再灌注损伤是一个多环节、多因素、多途径的酶促级联反应，作用机制复杂。同时孤啡肽受体的作用也涉及机体的多个方面。我们的实验只是为研究孤啡肽受体在脑缺血作用作一个初步的研究，有待进一步深入。参考文献：1MeunierJC,MollereauC,TollL.etal.Isolationandstructureoftheendogenousagonistofopioidreceptor-likeORL1receptor.Nature.1995,377:532-535.2ReinxcheidRK,NothackerHP,BoursonA,etal.OrphaninFQ:aneuropetidethatactivatesanopioidlikeGprotein-coupledreceptor.Science1995,270:792-794.3NelsonRM,CaloG,GuerriniR,HainsworthAH,GreenAR.LambertDG.Nociceptin/orphaninFQinhibitsischaemia-inducedglutamatNeeffluxfromratcerebrocorticalslice.Neuroreport.2000Nov,27:11(17)3689-92.4ArmsteadWM.Relationshipbetweennociceptin/orphaninFQandcerebralhemodynamicsafterhypoxia-ischemiainpiglets.AmJPhysiolCircPhysiol,2000,278：477-483.5KoizumiT,YoshidaYandNakazawaT,Experimentalstudiesofischemicbranedema:anewexperimentalmodelofcerebralembolisminratsinwhichrecirculationcanbeintroducedintheischemicarea.JpnJStroke.1986,8:1-8.6GarciaJH,WagnerS,LiuKFandHuXJ.Neurologicaldeficitandextentofneuronalnecrosisattributabletomiddlecerebralarteryocclusioninrats.StatsticalValidation.Stroke1995,26:627-634.7薛庆生.孤啡肽和其受体的研究进展J国外医学.麻醉学复苏分册,2002,（04）:236-238.8古航，胡电，洪新如，等.缺血缺氧新生鼠下丘脑及外周血孤啡肽含量的变化及意义J.中华妇产科杂志,2003,38(11):683-684.9ArmsteadWM.NOC/OFQcontributestohypoxic-