Cocktail 探针药物法在中药细胞色素P450 酶代谢研究中的应用[J].pdf

Cocktail探针药物法在中药细胞色素P450酶代谢研究中的应用*刘高峰,甄立棉,杨摇芳(哈尔滨医科大学附属第二医院药学部,黑龙江省高校重点实验室,150086)摘摇要摇细胞色素P450酶是人体内最重要的药物代谢酶,中药可抑制或诱导某个或某些细胞色素P450亚酶,从而影响合用药物的代谢,导致药物相互作用发生。中药代谢研究是中药现代化研究的重要方面,可提高中药使用的有效性和安全性,促进临床合理用药。Cocktail探针药物法能全面、真实地反映药物代谢的过程,其优点在于多个代谢途径的信息可在单个实验过程获得,并将个体间影响降至最低,此法省时、经济。Cocktail探针药物法用于中药的代谢研究是一个比较新的研究领域,近几年开始有文献报道。该文介绍了Cocktail法在中药细胞色素P450酶代谢研究中的国内外应用进展,以期系统了解并指导该领域的研究。关键词摇细胞色素P450酶；中药；Cocktail探针药物法；代谢；研究进展中图分类号摇R286；R965摇摇摇文献标识码摇A摇摇摇文章编号摇1004鄄0781(2009)08鄄1049鄄04摇摇细胞色素P450酶系(CYP450)是人体内最重要的药物代谢酶,由许多同工酶组成。与药物代谢密切相关的同工酶有CYP1A2,CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A41。据西北大学王玲玲等报道,其中有55%的药物经CYP3A4代谢,20%经CYP2D6代谢,15%经CYP2C9和CYP2C19代谢。细胞色素P450可受多种因素的影响,尤其是药物,可显著影响药酶的活性,使其诱导或抑制,并加速或减缓底物和其他药物代谢,这些构成了药物体内过程和药物相互作用的主要机制2。探针药物法是指某些经CYP450代谢的药物,以其代谢物和原型药的比例或速率衡量酶代谢能力变化的方法。将两种及两种以上经不同酶代谢的药物同时给予的方法称为“Cocktail冶探针药物法,即“鸡尾酒冶探针药物法。该方法最初主要用于评估药物在体内代谢方面的相互作用,现在的应用则更加广泛,可用于体内外测定CYP450酶的活性3。目前Cocktail法主要用于西药的药物代谢研究,在中药的药物代谢研究方面还是一个比较新的研究领域,但其应用价值和重要意义不容忽视。现就国内外Cocktail探针药物法在中药CYP450代谢研究中的应用进行综述,为该领域的研究工作提供参考。1摇Cocktail探针药物法的应用特点摇Cocktail探针药物法可以采用探针药物的清除率或者是探针药物与代谢产物在尿中、血中和唾液中的浓度比值等指标来评价酶的活性,采用液相色谱或者液相色谱质谱串联法等进行测定2。Cocktail法的优点在于多个代谢途径的信息可在单个实验过程获得,并将个体间影响降至最低,此法省时、经济。根据樊慧蓉等的观点,Cocktail法摒弃了体外研究中实验模型与收稿日期摇2008鄄10鄄15基金项目摇*黑龙江省教育厅基金资助项目(基金编号:11531114)作者简介摇刘高峰(1965-),女,黑龙江人,主任药师,硕士生导师,博士,研究方向:中药代谢与药物相互作用。电话E鄄mail:。体内真实环境差异大、不能较好反映体内代谢全过程等的缺点,能全面、真实地反映药物代谢的过程。Cocktail法可以同时测定几种主要的CYP450酶的亚型,在药物代谢酶研究中起着重要作用。使用Cocktail法应符合以下条件1,3:淤探针药物可得且易得,同时使用的探针药物在体内不能产生相互作用；于为有效评估同时使用探针底物后的药动学变化,必须保证每种探针药物有选择地作用于一种同工酶,具有高度敏感性,即使被几种亚型催化但已确知其各条代谢途径及其产物；盂在抑制药存在的条件下,探针药物在高浓度下仍维持其作用专属性,不发生对其他同工酶的抑制作用；榆探针药物在给予的剂量下应对所检测亚型的活性无影响；虞活体中在给予探针药物的剂量下其代谢应遵循一级动力学变化,并且其代谢不受肝血流和蛋白结合的影响；愚给药和采样应简单和无损伤,在给药剂量下应确保安全性；舆不存在潜在的对分析方法的干扰。2摇用Cocktail法研究中药有效成分对CYP450的影响见表1。2.1摇倍半萜内酯类摇青蒿素(artemisinin,别名arteannuin、artemisinine、qinghaosu)又名黄花蒿素、黄蒿素,是从中药青蒿中提取的倍半萜内酯物质,主要用于间日疟、恶性疟的症状控制。SARA等4研究了有关青蒿素类药物对不同细胞色素P450酶的影响,75例健康成人每天随机口服治疗剂量青蒿素、二氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯,共计5d,用咖啡因、香豆素、美芬妥英、美托洛尔、氯唑沙宗和咪达唑仑6种探针药物构成的鸡尾酒法,在第-6,1,5和10天口服,分别考查青蒿素等药物对CYP1A2,CYP2A6,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A活性的影响。结果显示,二氢青蒿素、蒿甲醚对CYP1A2有抑制作用,青蒿素第1天使CYP1A2活性下降,但到第5天又使CYP1A2活性增加；上述几种青蒿素类药物对CYP2A6的活性均无影响；青蒿素、蒿甲醚使CYP2C19的活性增加；二氢青蒿素对CYP2D6有抑制作用,青蒿素第1天使CYP2D6活性下降,但9401医药导报2009年8月第28卷第8期到第5天又使CYP2D6活性增加；青蒿素对CYP2E1有抑制作表1摇Cocktail法研究中药有效成分对CYP450的影响摇中药有效成分Cocktail法中CYP探针药物对CYP各亚型的影响倍半萜内酯类1A22A62C192D62E13A摇青蒿素1A22A62C192D62E13A+*10*2+-*3+摇二氢青蒿素咖啡因香豆素美芬妥英美托洛尔氯唑沙宗咪达唑仑-00-0+摇蒿甲醚-0+00+摇青蒿琥酯00000+生物碱类摇青藤碱1A22C92C192D62E13A4(体外)1A22C92C192D62E13A4(体外)咖啡因甲苯磺丁脲S鄄美芬妥英美托洛尔氯唑沙宗咪达唑仑00-0001A22C192D62E13A4(体内)1A22C192D62E13A4(体内)咖啡因S鄄美芬妥英美托洛尔氯唑沙宗咪达唑仑0-000黄酮类化合物摇绿茶儿茶素1A22C92D63A41A22C92D63A4咖啡因氯沙坦右美沙芬丁螺环酮000-皂苷类摇人参皂苷Re(1)1A23A4(1)1A23A4咖啡因氨苯砜摇+(2)2C192E1(2)2C192E1奥美拉唑氯唑沙宗00糖类摇硫酸多糖1A23A42E11A23A42E1(体内)1A23A42E1(体外)摇SPMG鄄911咖啡因咪达唑仑氯唑沙宗0-0-00摇AOSC鄄97100+00+摇摇*1药物对CYP亚型有诱导作用,*2药物对CYP亚型无影响,*3药物对CYP亚型有抑制作用用；上述几种青蒿素类药物均对CYP3A有诱导作用。2.2摇生物碱类摇青藤碱是我国沿用已久的抗风湿中药,具有消炎镇痛、活血化瘀、增强免疫力、降低血沉(ESR)、使类风湿因子(RF)阴转、改善功能障碍等作用,并有延缓类风湿关节炎(RA)复发时间及减轻复发症状的作用。YAO等5利用Cocktail法对青藤碱的代谢进行了研究。用6个探针药物对多种CYP450酶进行人体外研究(咖啡因CYP1A2、咪达唑仑CYP3A4、氯唑沙宗CYP2E1、S鄄美芬妥英CYP2C19、美托洛尔CYP2D6、甲苯磺丁脲CYP2C9),结果发现青藤碱使CYP2C19的活性下降了69%,对其他CYP450酶无显著影响。用5个探针药物对多种CYP450酶的活性进行的人体内研究,发现美芬妥英的消除增大了73%,即青藤碱使CYP2C19的活性降低了73%,对其他CYP450酶无显著影响。2.3摇黄酮类摇绿茶儿茶素有除臭、抗腐蚀、抗菌、抗氧化、抑制胆固醇升高、除去活性氧和抗癌作用等。对于可引发癌症和衰老等各种疾病的活性氧,绿茶儿茶素可以充分发挥其在细胞膜表面除去活性氧之功能。CHOW等6用Cocktail法考查了绿茶儿茶素对CYP450的影响,42例健康志愿者经过4周清洗期(即不饮茶及与茶有关的产品)后,给予4个不同的CYP450探针药物咖啡因、右美沙芬、氯沙坦和丁螺环酮,分别评估CYP1A2,CYP2D6,CYP2C9,CYP3A4的活性,再进行4周绿茶儿茶素的干预试验,结果发现绿茶儿茶素的干预并没有改变CYP1A2,CYP12D6,CYP12C9的活性,却使丁螺环酮的血药浓度鄄时间曲线下面积增大了20%,显示CYP3A4活性有轻微的降低。表明反复给予绿茶儿茶素不太可能引起由CYP450酶介导的药物代谢发生显著性变化。2.4摇皂苷类摇人参皂苷Re(GinsenosideRe)来自五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的根,具有益心宁神的功效。樊慧蓉等使用4种Cocktail探针药物氨苯矾、咖啡因、氯唑沙宗和奥美拉唑,通过药动学参数变化评价人参皂苷Re对大鼠肝细胞色素氧化酶P450亚型CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19的诱导或抑制作用。实验分两组进行:淤大鼠尾静脉同时注射探针药物氨苯砜(CYP3A4)、咖啡因(CYP1A2),于0.183,0.25,0.5,0.75,1,2,5,8和12h眼球采血,提取溶剂为三氯甲烷异丙醇(9010,V/V)；于大鼠尾静脉同时注射探针药物氯唑沙宗(CYP2E1)、奥美拉唑(CYP2C19),于2,5,10,15,30,45,60,220,250和300min经眼球采血,提取溶剂为己酸己酯。经高效液相色谱法测定,比较实验组和对照组的药物动力学参数,结果表明,人参皂苷Re对大鼠肝细胞色素氧化酶P450亚型CYP1A2、CYP3A4有诱导作用,而对CYP2E1、CYP2C19无影响。2.5摇糖类摇海洋硫酸多糖SPMG鄄911(简称911)和AOSC鄄971(简称971)都是中国海洋大学海洋药物与食品研究所研发的、具有自主知识产权的国家I类新药。采用“Cocktail冶探针药物法,分大鼠整体实验、大鼠离体实验以及人体离体试验3个途径,使用3种探针药物咖啡因、咪达唑仑、氯唑沙宗,通过药物代谢的药动学参数评价911和971对CYP450亚型CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1的诱导或抑制作用,以及这种作用是否存在性别差异。通过3个途径的试验,发现971对不同性别、不同受试者的CYP1A2和CYP3A4均无影响,体内外试验中对雄性大鼠CYP2E1均有明显的诱导作用。911在大鼠的整体实验(即体内实验)中,对雌雄大鼠的CYP1A2酶均无影响,对雌雄大鼠的CYP3A4酶均有显著抑制作用；而在体外试验中,911组对雄性大鼠和男性人肝微粒体咖啡因均有明显的抑制作用(即可能对CYP1A2有潜在的抑制作用),对大鼠和人的肝微粒体酶CYP3A40501HeraldofMedicineVol郾28No郾8August2009均无影响。3个途径的试验结果表明,911对CYP2E1酶均无影响,911对酶CYP1A2和CYP3A4的影响呈现出体内外结果不一致的现象,考虑主要与药物本身的结构在内外环境中的稳定性、对酶的稳定性以及酶本身的活性等方面的差异有关。3摇用Cocktail法研究中药提取物对CYP450的影响摇见表2。3.1摇同一种Cocktail法对几种中药提取物分别进行代谢研究摇MATTHIAS10对6种中药的提取物分别进行了实验。用LC/LC/MS法在体外同时检测中药提取物对6种主要的CYP450酶的抑制作用。用杆状病毒感染的昆虫细胞进行试验,CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4酶的底物经混合,孵化,最终代谢产物用LC/LC/MS定量。Cocktail探针药物包括他克林(CYP1A2)、紫杉醇(CYP2C8)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、米帕明(CYP2C19)、右美沙芬(CYP2D6)和咪达唑仑(CYP3A4),并对此方法进行了验证。结果钩果草提取物对CYP1A2和CYP2D6的抑制活性相对较低(IC50900滋gmL鄄1),对CYP2C8/9/19和CYP3A4的抑制范围是IC50100350滋gmL鄄1。钩果草提取物在Cocktail中对CYP2D6有抑制作用的IC50值范围是(1038依44)滋gmL鄄1,与用单个探针药物考查的结果一致用单个探针药物时对CYP2D6抑制作用的IC50值范围是(1044依80)滋gmL鄄1。龙牙草提取物的IC50值在低于100滋gmL鄄1时对CYP1A2/2C9有较强的抑制活性,100200滋gmL鄄1时对CYP2C8/19/3A4有较强抑制活性。胡柚汁在体内外对CYP450酶的抑制活性已有较多报道。选择正常浓度的胡柚汁,并根据其活性选择试验所用的中药提取物。有趣的是,胡柚汁在体外对CYP450的抑制活性相对于体内较弱(IC50400滋gmL鄄1),因为体内摄入的剂量(200g)比中药提取物的治疗剂量(1001000mg)高。红三叶草提取物IC50值在100500滋gmL鄄1时可降低各种CYP450酶的活性。胡椒属薄荷油在500滋gmL鄄1时会使各种CYP450酶(CYP3A4除外)的活性降低到20%。桉油对CYP450的抑制活性比薄荷油低,IC50值范围是大于100滋gmL鄄1,对CYP3A4的抑制活性相对较强。卡法根(即麻醉椒)提取物抑制所有CYP450的活性,IC50值在20100滋gmL鄄1时抑制CYP1A2/2C9/2C19的活性,在100500滋gmL鄄1时抑制CYP2C8/2D6/3A4的活性。3.2摇姜黄摇姜黄具有破血、行气、通经、镇痛等功效,含姜黄素类化合物、倍半萜类化合物、酸性多糖和挥发油等有效成分。扈金萍等8采用Cocktail探针药物法,通过对大鼠进行体内、体外实验来评价姜黄提取液对CYP450的影响,Cocktail探针药物包括咖啡因(CYP1A2)、氨苯砜(CYP3A4)、氯唑沙宗(CYP2E1),通过高效液相色谱法检测3种探针药物的代谢变化来评价姜黄提取液对CYP450各亚酶的影响,结果显示姜黄提取液对大鼠CYP1A2和CYP2E1有抑制作用,但对大鼠CYP3A4的影响不显著。3.3摇连翘摇连翘具有清热、解毒、散结、消肿等功效,可用于治疗温热、丹毒、斑疹、痈疡肿毒、瘰疬、小便淋闭等症状。连翘果实中含连翘酚、甾醇化合物、皂苷及黄酮醇苷类、马苔树脂醇苷等。果皮含齐墩果酸。闫淑莲等9用Cocktail法考查了连翘提取液对CYP450酶的影响,Cocktail探针药物包括咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗,分别检测CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1的活性。通过高效液相色谱法检测探针药物的代谢率来评价连翘提取液对CYP450各亚型的影响。结果显示连翘提取液对大鼠CYP1A2有抑制作用,对大鼠CYP3A4有诱导作用,但对大鼠CYP2E1的影响不显著。3.4摇贯叶连翘摇贯叶连翘(Hypericumperforatum)属藤黄科植物,其主要活性成分为苯并二蒽酮类衍生物金丝桃素和假金丝桃素,能透过血脑屏障进入大脑,通过系列反应达到缓解精神紧张和稳定情绪的效果。贯叶连翘也是一种受欢迎的OTC食品添加剂和草药治疗剂,与几个CYP450同工酶底物会产生药物相互作用。WANG等10用Cocktail法检测了贯叶连翘提取物体内对CYP450活性的影响,Cocktail探针药物包括甲苯磺丁脲(CYP2C9)、咖啡因(CYP1A2)、右美沙芬(CYP2D6)、口服咪达唑仑(肠道壁和肝脏CYP3A)和静脉注射咪达唑仑(肝CYP3A)。结果显示,短期内给予贯叶连翘提取物并没有影响CYP450的活性,长期摄入贯叶连翘提取物会对肠道壁CYP3A有显著选择性诱导作用,贯叶连翘提取物并不会改变CYP2C9、CYP1A2、和CYP2D6的活性。因此在长期摄入贯叶连翘提取物表2摇Cocktail法研究中药提取物对CYP450的影响摇中药有效成分Cocktail法中CYP探针药物对CYP各亚型的影响1A22C82C92C192D63A41A22C82C92C192D63A4钩果草提取物他克林紫杉醇甲苯磺丁脲米帕明右美沙芬咪达唑仑摇-*1摇-摇-摇-摇-摇-龙牙草提取物摇-摇-摇-摇-摇-摇-胡柚汁摇-摇-摇-摇-摇-摇-红三叶草提取物摇-摇-摇-摇-摇-摇-胡椒属薄荷油摇-摇-摇-摇-摇-摇-桉油摇-摇-摇-摇-摇-摇-卡法根提取物摇-摇-摇-摇-摇-摇-姜黄提取液1A22E13A41A22E13A4咖啡因氯唑沙宗氨苯砜-0*2连翘提取液1A22E13A41A22E13A4咖啡因氯唑沙宗氨苯砜-0+*3贯叶连翘提取物2C91A22D63A(肠壁/肝)3A(肝)1A22D62C93A(肠壁)甲苯磺丁脲咖啡因右美沙芬咪达唑仑咪达唑仑000+(长期)摇(口服)摇(静注)1501医药导报2009年8月第28卷第8期摇摇*1药物对CYP亚型有抑制作用,*2药物对CYP亚型无影响,*3药物对CYP亚型有诱导作用时,应考虑对CYP3A调控的药物代谢的影响所致的疗效降低。4摇Cocktail法的应用展望摇目前欧美各国己经把CYP450及其同工酶的测定用于新药的筛选及代谢研究,并将其列为新药申报必须进行的一项试验。我国在该领域的研究还处于探索阶段,但该研究的重要性和意义已逐渐被认识,在我国新药审批办法和药品注册管理办法中,已经要求新药研发必须进行药物代谢酶的研究。另外,国家在化学药物非临床药代动力学研究指导原则中指出,对于创新药物,应观察药物对药物代谢酶,特别是细胞色素P450同工酶的诱导或抑制作用。因此,简便快速的“鸡尾酒法冶将成为一个创新药物临床前药物代谢研究重要的和常用的手段。Cocktail探针药物法在国外应用的较多,主要用于西药的研究。用Cocktail法研究中药的代谢,国内外报道均比较少,是一个比较新的研究领域,目前的报道尚仅限于中药单一有效成分或单一中药提取物,对于复方中药的研究尚属于空白。由于Cocktail法在研究药物代谢方面的优势,若广泛用于中药的代谢研究,必将促进中药基础理论的研究和中药的现代化研究,同时,对于中药在临床上的合理应用,提高联合用药的安全性和有效性具有重要的实际意义。DOI摇10.3870/yydb.2009.08.028参考文献1摇樊慧蓉,和摇凡,刘昌孝.Cocktail探针药物法用于评价细胞色素P450同工酶影响的研究进展J.中国药学杂志,2006,41(14):1045-1048.2摇刘高峰,郭兴蕾.中药对细胞色素P450调控作用的研究进展J.中草药,2008,39(1):139-143.3摇刘摇颖,焦建杰,娄建石.“Cocktail冶探针药物法的研究进展J.中国临床药理学与治疗学,2006,11(11):1225-1229.4摇SARAA,DOAAE,TRINHN,etal.Artemisininantimalarialsmo鄄deratelyaffectcytochromeP450enzymeactivityinhealthysubjectsJ.FundamClinPharmacol,2007,21(3):307-316.5摇YAOYM,CAOW,CAOYJ,etal.EffectofsinomenineonhumancytochromeP450activityJ.ClinChimActa,2007,379(1-2):113-118.6摇CHOWHH,HAKIMIA,VININGDR,etal.EffectsofrepeatedgreenteacatechinadministrationonhumancytochromeP450activityJ.CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2006,15(12):2473-2476.7摇MATTHIASU,ANDREASF.Simultaneousdeterminationoftheinhi鄄bitorypotencyofherbalextractsontheactivityofsixmajorcytochromeP450enzymesusingliquidchromatography/massspectrometryandautomatedonlineextractionJ.RapidCommunMassSpectrom,2004,18(19):2273-2281.8摇扈金萍,闫淑莲,唐静成,等.Cocktail探针药物评价姜黄对肝细胞色素P450酶的影响J.首都医科大学学报,2004,25(4):427-430.9摇闫淑莲,扈金萍,徐艳霞,等.Cocktail探针药物同时评价连翘对肝细胞色素P450的影响J.中国药学杂志,2003,38(10):761-763.10摇WANGZ,GORSKIJC,HAMMANMA,etal.TheeffectsofStJohnswort(Hypericumperforatum)onhumancytochromeP450activityJ.ClinPharmacolTher,2001,70(4):317-326.难溶