不同给药方式下三氧化二砷对T 细胞淋巴瘤EL4 细胞体内及体外抑制作用.pdf

!癌症!#$%&%()*$+,(-.+$/%*#0112#03$0%&4556781!基础研究!79华南肿瘤学国家重点实验室广东广州54:8:09中山大学肿瘤防治中心内科广东广州57:8:!#$%$&()%*+,%$+,(+-./0+1+2(3/#+4$5653/%!74%/285+4!74%/29+/2!:!；653/%?&A%,$B&/$+-C&930%1./0+1+2(!6%/0&,6&/$&,!#4/D%$EF&/G/3H&,F3$(!74%/285+4!74%/29+/2!:!；653/%通讯作者!黄慧强!(*%&；($)#?#+$A)+$AB%,93890:93CDEDD5:FG+#,)+$AH&I&)J78D9/(G收稿日期!0113?15?07修回日期!0113?12?1D#!#$%&$(&)*%+,-.&-./01$231!#$%&!(&)*+,%&+-+.*%/)012&,(+3+4+%5&6+7*&(%+78(9698538(,*666+*):；,6+,!+%(6),(4*)*.%&*(%8(9)4%95*)7698538(:=?)A*?8+)%&%+B9)&%&8+?9%:；%3+)&)&C3!B*)%?+*?%3*%+%8&*77*C%7/)DEFB+%3.+77*&*%.8+)%&%+B9)GHC*66698538!.I)*&#*%3*%-+,+%9:41$5+.#J&+*GH,*66698538,*666+*KLMB()%&*(%*.B+%3/)NEF7O,*%&(%+)PQ*665&6+7*&(%+B().*%*,%*.49RSS()(9:Q*66(55%)+)B()*#(6(%*.4976B,9%8*%&9B+%3/*-+H!HT；SQUV；)%(+A!(.4)*&#*.*&*6*,%&),5*(.76&*),*%8+,&),5*:KLM,*66)B*&*+,6(%*.+%.*8+,*%*)%(46+)3698538(8.*6):S3*77*,%7/)01F698538(+%&%$%；QW&P0O86L%_03%!XPXW&Pa3*%&*%*?B+%3%3*)8*%6?)*7/)0EFI9M8A%bA?&c7&_?9)&N8A%bA?&d7&M?9)!%3*+3+I+%+&%*)7%8&A&B%3+8+C*B*&*e+#6*%WO:OY#):WW:fY!gXP2W&P/55%+CC*66)B*&*+C&*)*.55%+CI.+*)B*&*I)*&#*.+-*A&7%8&%+)*)P/C%*6+#*&.8A*+)%3*8h&%-+C+%9P8+-7,#2+-i3&%*+A%3*.8+)%&%+C&)*.+C&*)+A%3*.+69.)A*7/)NE2CI*C)+.*&*.)&*)I6*8.*67&%&*%+A.#C*.U&*7&C%&9698538)P91:；+%.#&)*+C%&+-+.*!GHC*66698538!KLMC*66)!.*8)*!-*A&7%摘要#背景与目的!体外实验证明!三氧化二砷%+*&%$#/=*#(K#%!L&0MD&单药可抑制多种恶性淋巴瘤细胞的增殖!并呈时间依赖性和浓度依赖性(临床研究也提示!L&0MD单药治疗多种病理亚型淋巴瘤有效(但目前L&0MD的剂量)具体用法仍未确定(本实验研究不同给药方式L&0MD对鼠源性B细胞淋巴瘤FNE细胞体内外的抗瘤作用!旨在了解L&0MD不同给药方法对B细胞淋巴瘤疗效及不良反应(方法!OBB法检测3种浓度L&0MD对FNE细胞的抑制作用!流式细胞仪分析)L$%K#$!?PQB.RSQ双标记检测细胞凋亡!电镜观察凋亡形态变化(建立FNE细胞裸鼠移植瘤模型!观察不同方案腹腔注射L&0MD对FNE裸鼠移植瘤的抑制作用及裸鼠的耐受情况(结果!与对照组相比!不同浓度L&0MD对FNE细胞均存在直接抑制作用%=T1915&!作用C0时的Q.51为7903G(,RN(体内实验显示!EGA%UA&67VC与0GA%UA&67V7E给药对裸鼠移植瘤的抑制作用相近!抑瘤率分别为5393W不同给药方式下三氧化二砷对?细胞体内及体外抑制作用高岩40蔡清清40李苏40卜庆40廖红40周颖40黄慧强40=1$#+&%#1-2$%2+A2.1,-.1%.21%1-$&.B2-2#$%&$2+-；&:#+-C1777:BD5+B&A1-+*%&$#2-,.1B212-323+&-.2-32$%+1AD1%2B1-$#jk!0l+AHl+AQ+!0iL+!0l+A=!0mAL+!0j+n3!N.m+Hl+AmA!N!CMYK恶性淋巴瘤是造血系统常见恶性疾病之一!目前!细胞来源的非霍奇金淋巴瘤#$%#&()*+,-./0#.1!2%3#化疗效果差!预后不良!特别是复发难治!细胞4%3预后凶险$挽救方案有效率在5678967!缓解时间较短!长期缓解率约为:67!自体造血干细胞支持下的超大剂量化疗能够明显提高其远期疗效!但仍有相当部分患者死于2；3复发$因此!临床上仍需寻找新的药物以期能进一步改善4；3预后$三氧化二砷1?#公司产品$I!及二甲基亚砜NIOC%为O).1公司产品$A=)PQDJ双染凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司$鼠源性!细胞淋巴瘤细胞株RSF购自中国科学院上海细胞库$细胞培养在含:67小牛血清&:66TQ.S青霉素和:66!Q.S链霉素的HDUJ$:KF6中!置于5GV&含97WCB的培养箱中$取处于对数生长期的RSF细胞为实验对象$BF只98K周龄的XA3XQW裸鼠!ODY级!雌雄各半!由广州中医药大学实验动物中心提供$许可证号OWZ:粤B665666:!粤监证字B66KA6:B$!#$%法检测&#()对*+,细胞活力的影响将处于对数生长期的R3F细胞制成BZ:6FQ.3的单细胞悬液!按每孔:66!3约BZ:65个细胞%接种于K孔板!置于5GV&97WCB培养箱中$加入细胞的同时!实验组分别加入含不同浓度6E:&6E5&6E9&6EK&6E_&:E6&BE6!.#,Q3和5E6!.#,Q3%A+BC5的HDI$:KF6液含97小牛血清%(细胞对照组加入含97小牛血清的HDI$:KF6液$每个浓度设_个复孔!每孔B66!3$置于5GV&97WCB培养箱中孵育F_0及GB0后!每孔加入新鲜配制的B.Q.3的I!液B6!3(F0后每孔加入:67NIOC液B66!3!温箱中静置过夜$次日取出K孔板!在O/=?1I1IB酶标仪上以实验波长9G6.!参比波长F96.测定吸光度值)!值%$按下式计算细胞增殖抑制率!抑制率a:实验组!值Q对照组!值%Z:667$根据公式3W96a!b)cb)c:%D)c:D)%QB计算半数抑制浓度W96%$!)流式细胞仪!荧光显微镜及电镜检测细胞凋亡流式细胞A=)PQD双染色法检测经A+BC5作用后R3F细胞的凋亡比例$将处于对数生长期的R3F细胞接种于K孔板!每孔约B666个!置于5GV&97WCB培养箱中(加入细胞同时!实验组分别加入含不同浓度6E:&6E5&6E9&6EK&6E_&:E6&BE6!.#,Q3和5E6!.#,Q3%A+BC5的HDI$:KF6液含97小牛血清%(细胞对照组加入含97小牛血清的HDI$:KF6液$培养F_0及GB0后收集细胞!DXO洗一次!加适量的DXO重悬!取9!3细胞悬液!加入9!3D染液!轻轻混匀!室温避光放置9.)后滴加于载玻片上!加盖玻片!荧光显微镜!蓝光XL:B滤光镜观察!拍照$剩余细胞悬液经流式细胞仪检测!并在电镜下观察细胞形态$!,裸鼠移植瘤模型的建立及治疗于B只XA3XQW裸鼠右侧腋下接种R3F细胞!每只GZ:6K个细胞约6EB.3%!G&后明显成瘤取出待用$在生理盐水中将瘤体切割成5.Z5.Z5.大小的肿块!B6号穿刺针把瘤块移植于BF只裸小鼠腋下!待肿瘤长至直径约9.时大约在接种后第9天左右%随机分组如下对照组生理盐水B.3!腹腔注射(#AG组A+BC5F.*(*&%:给药G&后停药($A:F组A+BC5F.*(*和99EK7a6E59:%$移植瘤组织凋亡细胞增多并可见凋亡小体生成$毒性表现主要为急性肝损害的病理学变化$结论A+BC5体外可抑制R3F细胞增殖并可以诱导细胞凋亡!在总剂量相同的情况下!F.*(*&%:ZG&与B.*(*&%:Z:F&的给药方式对裸鼠移植瘤生长的抑制作用近似$关键词三氧化二砷(!细胞(淋巴瘤(R3F细胞(裸鼠(移植瘤(抑制作用中图分类号HG5$5:(H:9EF文献标识码A文章编号:666FKGbB66%6B6:996K高岩!等E不同给药方式下三氧化二砷对!细胞淋巴瘤R3F细胞体内及体外抑制作用!#CMYK表!#$%&作用()及*$)对+,细胞凋亡的影响-./01!+2213452.6#1783468598:1!#$%&57.；5；45#8#52+,3100#!#$%!&()*+,-+,%+,.+,/+,0-,+#,+%,+102-#,-+3+,#-.,%43+,#0#+,#%3+,#/#/,403+,%5%+,013+,.111,+-3+,10.,153+,1-05,-.3+,%#5#2-4,+.3+,#4#.,-%3+,10%,+13+,1-1+,#.3+,/511,0-3+,#/.0,543+,.%50,4-3+,1#41,+43+,/0!66789:7；!；:9；69；?7；:&；:?3ABC0D；(,E-给药5后停药观察至第-1天#F-1组$!#$%#&G%!HG%E-给药-1&于接种后第0天对照组腹腔注射生理盐水+,#&*-I-1共-1次#!5组腹腔注射!#$%1&G)HG+,#&*-I5共5次#给药结束处死实验动物&!-1组腹腔注射!#$%1&G)HG+,#&*-I5共5次停止给药后观察肿瘤大小(动物耐受情况至第-1天后处死实验动物#F-1组腹腔注射!#$%#&G)HG+,#&*-I-1共-1次第-/天处死实验动物&处死裸鼠取肿瘤组织称重按照公式计算瘤重抑瘤率!JK$JKL-E实验组瘤重)对照组瘤重M-+N(8?G78&；BO$BOL!M(G#%M(G!-+&!$肿瘤生长时间-$最大肿瘤体积+$初始肿瘤体积&!#光镜下观察肿瘤组织和肝组织的变化停药#后取新鲜肿瘤组织固定于-+9；-J?28N879Y；CC；Z7C:9；?8Z798V8；!#$%?69(8C；9:78?CQ*1Z；(图#荧光显微镜下观察!#$%处理102后Q*1细胞的凋亡X8G9；#!6678CQ*1Z；(:C7；9102979；:7&；?7C:9；?8Z798V8；!#$%N；9=；?；9C(9；Z；?7&8Z9Z6；!$O2；&；&N9:?；C:66778ZQ*1Z；(87:8?；8?G9；?!?；V8?WM1+,F$O2；?Z(；8C:66778ZQ*1Z；(87:8?；8?9；!RJM1+,!F高岩!等,不同给药方式下三氧化二砷对O细胞淋巴瘤Q*1细胞体内及体外抑制作用!#CMYK表!#!$%对&(细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用)*+,-!./01+12345-66-7236#!$%3/84392036&(:-/384*622；341/；=-17-!#$%&#(#)*+*,-.,-./0#/1%/23/4(567689576:；,7；9；76,；67:69,78:；67:9,7,+*=(/1%/23/4(；-7,967557:6967-5587-?9678；87967；?7；:967；6F57-?9675:F5769675+FG4E2H2(2B4F(/!IJ+7:7-,78:9；67,；,；7:698；,7:+-；,7+98；7+8-8+；7,9-；76；7?；O.P!Q,6:RS786967:?7696757869576:7?59?7?.BTMCU2DE(!DAEU32VU24VB4(B)DB$%B4)MUVU2KUL24WUV(2BXB04B3F)NF)24/#*+DB$%/V/2K/L(/F(3/4(B0*N；Y8HM-3D$!ZD$LJ?0B+LFMN#*?-DB$%/V/2K/L(/F(3/4(B0*N；Y8HM-3D$!ZD$LJ?0B?-LFMN#.?-DB$%/V/2K/L(/F(3/4(B0*N；Y8HM；3D$!ZD$LJ?0B?-LFMN7FVEDB$%VBX(F2XUL32VU#HB(E*+FXL*?-DB$%NEFLBXU32VUL2ULL$2XDU1%U23UX(7*)KF)$UNFU%UNUX(ULFN3UFX9B0U)UKFX(DB$%N7F!6766?%KN7VBX(B)7!#$!%&对裸鼠移植瘤的抑制作用*+组&*?-组&.?-组的抑瘤率分别为+7:I&7I和7I%平均瘤重均明显轻于对照组!6766?#*?-组平均瘤重与.?-组相比差异无统计学意义!_678E后电镜下S-细胞形态!Q666a2D$U8*%B%(BN2NB0S-VU)NF0(U-bEB$(UF(3U4(B067?!3B)RS*N；Y8BHNUKUL$4LUU)UV(B432VBNVB%U!Q666*)PU)4$V)U$NVB4LU4NUN24VUNVU4(NEF%U%F4LVU)3U3HF4U2NLU%F$%UF(UL7.)PU)3U3HF4U2NVU4$)F(ULF4LKFV$B)$NDU4UF(UL%VU)4$V)U$N2NLU%F$%UF(UL7*.图-*N；Y8对S-细胞瘤鼠移植瘤生长的抑制作用a2D$U-cBC(EV$KUNB0S-1UXBDF0($3BF0(U(UF(3UX(B0*N；Y8AEU32VU2XVBX(B)DB$%BX)MUVU2KUT2XWUV(2BXB0XB3F)NF)2XU#*+DB$%UVU2KUT(UF(3UX(B0*N；Y8HM-3D$!ZD$TJ?0B+TFMN#*?-DB$%UVU2KUT(UF(3UX(B0*N；Y8HM-3D$!ZD$TJ?0B?-TFMN#.?-DB$%UVU2KUT(UF(3UX(B0*N；Y8HM；3D$!ZD$TJ?0B?-TFMN7FVEDB$%VBX(F2XUT32VU7*+组&*?-组&.?-组肿瘤倍增时间分别为?7:T&；76；T&；7?；T%对照组肿瘤倍增时间为?7:T(!&淋巴瘤裸鼠移植瘤的组织病理学改变各组移植瘤均见瘤细胞浸润横纹肌组织(光镜下对照组细胞形态不规则%核深染%致密%核浆比例增大%核分裂相多见(*+&*?-&.?-组经*N；Y8作用后瘤细胞形态较对照组规则%细胞皱缩%核固缩或碎裂%核分裂相减少%凋亡细胞增多并可见凋亡小体生成!见图(!实验过程中毒性观察指标*+组和*?-组各有?只裸鼠出现；-E体重下降大于?D情况%此；只裸鼠分别于实验过程第&?天死亡(对照组肝脏检查未见异常%.?-组肝细胞形态基本正常%可见少量灶性胞浆疏松及空泡变性(*+组和*?-组实验动物可见轻至中度肝细胞损害%主要表现为水样变性及空泡样变性等(死亡的；只裸鼠肝细胞可见较严重急性肝细胞坏死(*+组经*N；Y8作用+T后白细胞数值均下降明显%与对照组相比差异有统计学意义!_6766?%见表?(血红蛋白及血小板变化无统计学意义!d676(但*?-组在高剂量作用并停药一段时间后血常规基本恢复正常%故可认为*N；Y8的骨髓毒性为可逆高岩!等7不同给药方式下三氧化二砷对A细胞淋巴瘤S-细胞体内及体外抑制作用!#CMYK性!骨髓毒性可耐受!讨论目前!国内外尚无比较!#$%给药时间及剂量的实验研究本研究中我们通过建立&细胞淋巴瘤()细胞裸鼠移植瘤模型!观察!#$%不同给药方式下对()细胞体内外的抑制作用及裸鼠的耐受情况结果显示!#$%具有抑制()细胞增殖作用!且呈时间和浓度依赖性!其主要作用机制为诱导细胞凋亡!并通过流式细胞仪检测#电镜观察等证明!#$%)*+,-+./0组与#*+,-+.1)0组相比抑瘤率相当$!#$%)*+,-+./0组有骨髓抑制出现!主要为白细胞下降!停药后可迅速恢复国内外使用!#$%治疗其它肿瘤模型裸鼠实验中未见明显白细胞下降而在肝脏毒性方面!高剂量组裸鼠肝脏病理切片均可见程度不等的肝细胞损害!与杜彩文等%1&报道相似另外!还观察到高剂量组裸鼠出现体重下降现象!与(23等%#&报道相符而在更高剂量组研究中!我们曾尝试使用456*+,-+剂量!在给药后裸鼠出现更显著活动下降及蜷缩不动现象!因此认为此剂量组毒性较大本研究结果提示!#$%用于治疗淋巴瘤是可行有效的!而且相同总治疗剂量前提下缩短给药时间#提高单次给药剂量的方式与常规每天给药方式疗效相当!不良反应基本可以耐受国内外多项药代动力学研究表明!常规!#$%进入人体后除少数组织器官存在蓄积倾向外!并无血液累积倾向当前众多临床研究采用剂量及给药时间长短不尽相同!使用剂量7876578%*+,-+之间均有报道!给药时间多为1)0左右有学者尝试采用每天不同的剂量或不同的给药间隔进行!#$%的临床研究9:；:2?；等%)&用7876*+,-+!#$%治疗AB9患者C32?+D?等%=&使用!#$%联合放疗及热疗治疗进展期头颈癌!为每周热疗前给药一次!采用最大剂量为每周%7*+!未见明显毒性反应!是迄今单次最大给药剂量报道王京华等%4&研究!#$%隔日给药与每天一次给药治疗!E(!两者相比差异无统计学意义因此!#$%的给药模式很值得进一步探索!以确定这一模式临床应用的可行性在应用!#$%治疗!E(获得成功之后!近年治疗淋巴瘤的报道逐渐增加目前!已有国内外学者应用!#$%单药治疗淋巴瘤患者C；*220小鼠鼻咽癌移植瘤的初步实验研究%N&8肿瘤防治杂志!#777!6M(*%=7I%=%8(23O!EP9!BD+Q!；RP?8$SSD2RDTP；R2DU20；D；?3?PP2D*P2；%N&8JP；92!#774!M/(*4/=I6189:；V!9:；WQ!VPC!；RP?89R302；D?2P?；TT2PXPD-2DT?DYZ0D；P；R2DU20；2R:；R；PR*；3R；SD*X；?DXR2?；3-；*2P*PD*SP2DD；R2DP?0DP+；%N&8(；3-；*2P!#771!1=图=!#$%作用后()移植瘤组织中的细胞凋亡#C.#77$G2+3；=J；?PSDSRD22()U；D+PTRR3*DPTR；R；PR*；?P；2；P；0Y2R:PSDSRDR2D02；D；02U；D+PTRR3*DR23；PTR；!#$%R；PR*；R8%1&%#&%&高岩!等8不同给药方式下三氧化二砷对&细胞淋巴瘤()细胞体内及体外抑制作用!#CMYK!#!$%&()*+,-./0$(,1)20$31+4567.8*09$-81,:*15-；?71.5-4+)8.+7A+-+4B18+-4856+8*?5B,158+)5?4.7?8758=?1.5-4+)8.+7A+-6+8*.1+18+7414*?B-.8*-.L14)-*-1144-)2)14)-.%0&C；4803?B-.8*-.+1$FGGH$FF!#M&$#MC王京华$李晓云$董敏$等C三氧化二砷隔日给药治疗急性早幼粒细胞白血病的临床观察%0&C中华血液学杂志$FGG!$N!FH#!GO!GNC3-.+4-E$97-141,B*1+48-.-.74+4B18+-4856+8*.-,1B5-Q.-.1)87.?1=,8RS)-,-=2-+1Q,?B*71%0&C3-+4=)-51B7B875+57)=814-7=5R)-,?B*7-4)-7.1B1.8+1,?)15B15-S+4-B-4-48B18*61?14B78-48+18+74P?15)7.P+)1)+!L+81+4D%0&C0；4L-589-.187,$FGG#$&F&!%#NN&$NM#C侯淑玲$张巧花$王军$等C三氧化二砷治疗难治性恶性淋巴瘤近期疗效%0&C中国肿瘤临床$FGG!$#F!F%#&%F!$&%FHC黄勇$杨宁蓉$秦叔逵$等C三氧化二砷注射液治疗难治性非霍