不同中药复方对3 种鸡细菌性腹泻病原菌的体外抑菌试验.pdf

174疾病防治中国畜牧兽医2010年第37卷第1O期不同中药复方对3种鸡细菌性腹泻病原菌的体外抑菌试验张丁华。，王艳丰，许兰菊，朱金凤，尹凤阁(1河南农业职业学院动物科学系，中牟451450；2河南农业大学牧医工程学院，郑州450002)摘要：为研究中药复方对3种鸡细菌性腹泻病原菌的抑制效果，采用纸片法对自拟的6个中药复方进行敏感性试验，并用试管二倍法测定中药复方的最小抑菌浓度。结果表明，6个中药复方均具有不同程度的抑菌作用，其中复方4对大肠杆菌的抑菌效果较好，平均抑菌圈直径为212mm，平均M1C值为625mgmL；复方1对沙门氏菌效果较好，平均抑菌圈直径为198Film，平均MIC值为417mgmI；复方3对多杀性巴氏杆菌效果较好，平均抑菌圈直径为233mm，平均MIC值为392mgmI，3个复方均呈高度敏感。表明中药复方可以用于鸡细菌性腹泻的防治。关键词：中药复方；鸡；细菌性腹泻；体外抑菌中图分类号：$8539文献标识码：B文章编号：1671-7236(2010)100174一O4引起鸡腹泻的因素多且复杂，根据其病因不同，可分为传染性腹泻和非传染性腹泻两大类(刘唁威等，2005)。研究结果表明，鸡急性腹泻是由细菌和病毒共同作用引起的，但在引起雏鸡腹泻的诸多病原中，以细菌性因素最为常见，至少占46，是主要病因；其中肠杆菌科细菌作为细菌性腹泻的主要病原已得到证实，且以大肠杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌最为常见。据调查，腹泻在1月龄内雏鸡中的发病率为1030，致死率可达5O(魏建平等，1990)。目前，鸡细菌性腹泻的控制主要是应用抗生素，但由于抗生素的不合理使用，导致超强耐药菌株出现和抗生素残留。因此，从传统中草药中筛选出有效的抗大肠杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌药物，对于保障食品安全和公共卫生安全具有十分重要的意义。1材料与方法11材料111中药白头翁、马齿苋、黄柏、黄连、金银花、诃子、陈皮、木香、藿香、山楂、郁金、贯众、丹参、黄芩、白芍、车前子、大黄、大青叶、黄芪、蒲公英、夏枯草、丹皮、紫花地丁、秦皮、板蓝根、苍术、苦参、穿心莲、常山、葛根、甘草、鱼腥草、桔梗、连翘等，购于中收稿日期：2O1O一0416作者简介：张丁华(1976一)，女，河南人，讲师，硕士，研究方向中西兽医结合、中兽药的研制与开发。通信作者：王艳丰基金项目：河南省重大科技攻关项目(092102110034)。牟某医药公司。依据中药配伍原则，按一定比例自拟6个复方：白头翁、马齿苋、黄柏、黄连、金银花、诃子、陈皮、木香、藿香、山楂；黄连、郁金、贯众、藿香、丹参、黄芩、白头翁、白芍、车前子；黄连、大黄、大青叶、黄芪、蒲公英、夏枯草、丹皮、紫花地丁、黄芩、白头翁；黄柏、黄连、秦皮、大黄、板蓝根、苍术、苦参、穿心莲、常山、黄芪、葛根、黄芩、甘草；黄连、鱼腥草、桔梗、白头翁、藿香、诃子、连翘、黄柏、夏枯草、大黄；黄连、黄柏、秦皮、白头翁、诃子、藿香、山楂、郁金、甘草。112试验菌株从河南省不同地区自然分离的鸡致病性大肠杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌。113培养基普通琼脂培养基、麦康凯培养基、血琼脂培养基，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。114主要仪器及器材恒温培养箱、高压灭菌锅、真空干燥箱、定性滤纸、接种环、三角瓶等。115对照药敏纸片头孢哌酮、阿米卡星、庆大霉素、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。12方法121中药煎剂制备6个复方制剂均采用水提法(喻华英等，2009)进行。将每个复方的各中药成分均按所配伍的剂量称取，加81O倍的蒸馏水，浸泡30min后煎煮，煮沸后文火煎20min，用4层纱布过滤药液，取药渣加8倍量蒸馏水煎煮，煮沸后文火煎20min，用4层纱布过滤后，合并2次滤液，用文火浓缩至药液中生药含量为1gmL，120。C高压中国畜牧兽医2010年第37卷第1O期疾病防治175灭菌15min，置于4。C冰箱保存备用。122菌液制备将菌种接种于普通琼脂培养基或血琼脂培养基上，37培养24h，挑取典型菌落接种于新鲜肉汤培养基中，37。C培养18h，将大肠杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌培养物浓度分别稀释至10CFUmI、10CFUmI2000个mI，备用。123药敏纸片制备将滤纸用打孔器打成直径6mm的圆片，每100片放人一小瓶中，120。C干热灭菌2h。在超净工作台中将制备好的中药药液1mL加入100片纸片中，室温浸泡2h，用培养皿干燥法干燥，4保存备用(安丽英，1998)。124体外药敏试验分别取大肠杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌普通肉汤培养物，均匀涂布于营养琼脂平板上，待干燥后用镊子夹住白拟中草药复方药敏纸片和抗生素药敏纸片按顺序平均分布于琼脂表面，每个平板按需要放67个药敏片，每个平板做3个重复，37培养24h后用直尺测量抑菌圈直径。判断标准：抑菌圈直径19mm为高度敏感；14-19mm为中度敏感；1014mm为低度敏感；10mm为耐药(郭小清等，2004；张传津等，1996；胡晓苗等，2007)。125最小抑菌浓度(MIC)测定根据药敏试验的结果，选取抑菌效果较好的中药复方，测定其对供试菌株的最小抑菌浓度，采用试管二倍法进行(马兴树，2006；陈虹等，2009)。以大肠杆菌对复方1的MIC测定为例。取13mm100mm灭菌试管11支，编号，每管先加入无菌普通肉汤培养物20mI，然后于第1管中加入无菌的受试中药水煎剂20mI，混匀后取出20mL放入第2管中，依次类推。直到第9管，弃去20mL，第10管不加药物，作阳性对照，第11管加无菌受试中药水煎剂20mI，混匀后取出20mL，弃去，不接种细菌，作阴性对照。各管作3个平行重复。无菌操作取细菌稀释液01mL分别加入上述11O管中，混匀，第11管中加入灭菌生理盐水01mI，置各管于恒温箱中37。C培养24h，观察结果。结果判断按王晓晖等(2009)所述方法进行。2结果与分析21中药复方对大肠杆菌体外抑菌试验结果中药复方对大肠杆菌的体外抑菌试验结果见表1。由表1可知，6个中药复方对鸡沙门氏菌均有抑制作用，其中以复方4效果最好，平均抑菌圈直径为212mm，平均MIC值为625mgmL，呈高度敏感。复方6也有较好效果，呈中度敏感。表16个中药复方对大肠杆菌体外抑茵结果。，大肠杆菌02大肠杆菌()7s大肠杆菌O1平均抑菌直平均MIC复方编号。一直径(mm)MIC(mgmI)直径(mm)MIC(mgmI)直径(ram)MIC(mgmL)径(mm)(mgmI)111521503150420551256170庆大霉素10头孢哌酮141201451652201051651518注：*表不耐药，*表不中介，*表不敏感。FI司。22中药复方对沙门氏菌体外抑菌试验结果中药复方对沙门氏菌体外抑菌试验结果见表2。由表2可知，6个中药复方对鸡沙门氏菌均有抑制作用，但以复方1效果最好，平均抑菌圈直径为198mm，平均MIC值为417mgmL，呈高度敏感。复方2也有较好效果，呈中度敏感。23中药复方对多杀性巴氏杆菌体外抑菌试验结果中药复方对多杀性巴氏杆菌的体外抑菌试验结果见表3。由表3可知，6个中药复方对鸡多杀性巴氏杆菌均有抑制作用，但以复方3效果最好，平均抑菌圈直径为233mm，平均MIC值为392ragmL，呈高度敏感。复方5也有良好效果，亦呈高度敏感。3讨论本试验所用中药，是在相关文献普遍报道和作者长期实践基础上选择的，结果表明，6个中药复方对鸡大肠杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均有不同程度的抑制作用。其中复方4对大肠杆菌效果最好，复方1对沙门氏菌效果最好，复方3对巴氏杆菌效果最好，均呈高度敏感。3个复方中药配伍均以176疾病防治中国畜牧兽医2010年第37卷第1O期强力霉素1812诺氟沙星12814“6256252506256256251阿米卡星环丙沙星清热燥湿，凉血解毒为主。复方中选用的黄芩、黄连、诃子、大黄、五味子等中药，经试验证明，对大肠杆菌和巴氏杆菌均有良好抑制作用(王晓辉等，2009)。中药复方与抗生素相比，两者对3种细菌均有不同程度抑制作用。但同一种抗生素对不同供试菌株敏感性存在较大差异。如大肠杆菌试验组，庆大霉素对O和O分别表现为耐药和敏感，而中药组对不同血清型、不同来源、不论是否耐药，均有一定抑制作用。许多资料表明，清热解毒药和清热燥湿药可通过消除R质粒，抑制B一内酰胺酶等机制而消除病原菌对抗生素的耐药性(许虹等，2009；梁春梅等，2001)。本研究所选组方均以清热解毒中药为主，不仅具有良好的抑菌效果，而且还可消除耐药性，表明中药制剂替代抗生素治疗鸡细菌性腹泻是可行的，且还可减少使用抗生素产生耐药性和药物残留的问题。本试验采用传统的水煎液提取方式，操作简便易行，成本低，在相同条件下进行中药比较筛选时，容易控制试验条件，误差小，重复率高，可在较短的时间内完成大量中草药方剂的筛选工作，是一种能有效运用于临床的较为可取的好方法(陈希文等，2009)。采用药敏纸片法测定中药复方的抑菌效果，不但方便简单，而且能测定出药物的大致抑菌范围，对药效更具说服力。中草药对菌株的直接抑制作用主要是通过干扰微生物的酶系，破坏其正常的新陈代谢，抑制酶的活性；使微生物的蛋白质凝固和变性，干扰其生存和繁殖；改变细胞膜的渗透性，使其体内的酶类和代谢产物逸出导致其失活而达到抑菌作用的。但中草药的成分复杂，其抗菌作用可能是单一成分，也可能是多种成分共同作用的结果。本试验对6个中药复方的水提取物进行了体外大肠杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌的抑菌试验，这些提取物往往是多种成分的混合物，究竟是哪一种成分的抑菌效果最好，还有待于进一步研究。参考文献1马兴树禽传染病实验诊断技术M北京：化学工业出版社，2006。1061O72王晓晖，刘亭歧，陈波，等14种中药及其组方对临床常见致病茵的抑菌作用J畜牧与兽医，2009，41(8)：74773刘英姿，安娜，周铁忠中药主要免疫活性成分的药理学研究进展J3中国畜牧兽医，2009，36(12)：12841324安丽英兽医实验诊断M北京：中国农业出版社，l998，4244305许虹，杜海燕。牛艺儒中药对细菌耐药质粒消除作用的研究进展0OOOO5中国畜牧兽医2010年第37卷第10期疾病防治及概况J河南畜牧兽医，2009，29(8)：10116陈希文，王雄清，代敏，等24种中药对猪沙门氏菌的体外抑菌活性J江苏农业科学，2009，5：1802057陈虹，刘磊，吴润，等中草药复方对畜禽肠道病原菌的体外抑菌试验J安徽农业科学，2009，37(13)：600560068胡晓苗，江丽，张丹俊，等中草药抗禽巴氏杆菌病的研究J中兽医医药杂志，2007，3：32349郭小清，唐莉苹，聂建超救鸡宝中药复方颗粒剂对大肠杆菌的体内外抑菌效果观_J中兽医医药杂志，2004，4：791O梁春梅，许建邦，曹丽霞浅谈耐药性与清热解毒中药J内蒙古中医药，2001，1：5811喻华英，陈伟，单俊娟自拟中草药复方对奶牛乳房炎致病菌体外抑菌试验J中兽医医药杂志，2009，3：384OBacteri0stasisTestinvitroofDifferentTraditionalChineseMedicinestoThreeKindsofPathogenicBacteriaCausingChickenBacterialDiarrheaZHANGDinghua，WANGYanfeng，XULaniu。，ZHUJinfengl，YINFengge。(1DepartmentofAnimalScience，HenanAgriculturalVocationalCollege，Zhongmu451450，China；2CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)Abstract：InordertOstudythebacteriostaticeffectoftraditionalChinesemedicinesonthreekindsofpathogenicbacteriacausingchickenbacterialdiarrhea，paperstripmethodwasappliedtOcarryoutsensitivetestsof6self-madetraditionalChinesemedicines，andthetubedilutionmethodwastakentOtesttheminimalinhibitoryconcentrationofthetraditionalChinesemedicinesResultsshowedthatthe6traditionalChinesemedicineshavevaryingdegreesofbacteriostasisAmongthe6traditionalChinesemedicines，Compound4hadbetterbacteriostasisonEscherichiacoli，theaveragebacteriostasiscirclediameterwas212mm，andtheaverageMICvaluewas625mgmI；compound1hadbetterbacteriostasisonSalmonellabacillus，theaveragebacteriostasiscirclediameterwas198mm，andtheaverageMICvaluewas417mgmL；compound3hadbetterbacteriostasisonPasteurellamultocida，theaveragebacteriostasiscirclediameterwas233mm，andtheaverageMICvaluewas392mgmLThethreecompoundsassumedhighsensitivityindicatedthatthetraditionalChinesemedicinescouldbeusedinthepreventionandtreatmentofchickenbacterialdiarrheaKeywords：traditionalChinesemedicines；chicken；bacterialdiarrhea；bacteriostasistestvitro在湿热气候条件下补充脂肪和精料对高产奶牛生产性能的影响MoallemU等著王建平摘译臧长江校摘要：选择42头体重621kg、产后158d左右的经产以色列荷斯坦奶牛，研究能量来源(精料和脂肪)对湿热条件下奶牛生产性能、反刍时间、能量平衡、代谢热产出和饲料效率的影响。试验牛分为