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丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤的保护作用研究丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤的保护作用研究 -- 260 元

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分类号R72密级公开单位代码10422学号200812861⑧∥菇办孑博士学位论文论文题目丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤的保护作用研究ProtectiveEffectofEthylPyruvateonHypoxiaIschemiaInducedWhiteMatterInjuryinImmatureRatBrain合作导师2013年5月12日原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。、卞,.,t7论文作者签名立缘.啦日期趁f互臣z关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定论文作者签名立蘧亟导师签名乏至垄2日期硷2查厶至山东大学博士学位论文目录中文摘要.1英文摘要.5符号说明.8引言..10第一部分新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤及丙酮酸乙酯的干预作用研究材料和方法17结果.25讨论..28附图表..32参考文献..42第二部分丙酮酸乙酯对新生大鼠缺血缺氧后脑内炎症反应的作用研究材料和方法47结果.52讨论..53附图表..57参考文献..62第三部分丙酮酸乙酯在新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤保护中的抗凋亡作用材料和方法67结果.75讨论..77附图表..82参考文献..85全文总结.89致谢90攻读学位期间发表的学术论文91学位论文评阅及答辩情况表92英文文章193英文文章2..117山东大学博士学位论文CATALOGUEChineseabstract1Englishabstract.5Symbolicdescription..8Introduction1PartITheeffectofethylpyruvateonhypoxiaischemiainducedwhitematteinjuryinprematureratbrainMaterialsandmethods......................17Results................................25Discussion。.28Tablesandfigures...。。......。........32References...。................42PartIICerebralinflammatoryresponsesafterhypoxiaischemiaandtheeffectofethylpyruvateon甜ialactivationandcytokinesexpressionMaterialsandmethods......................47Results.............................52Discussion...........................................................................................................53Tablesandfigures....................57References..............62PartIIIProtectiveeffectofethylpyruvateonapoptosisafterhypoxiaischemiaMaterialsandmethods.................67Results..................................................................................................................75Discussion........................77Tablesandfigures......................82References.....................85Conclusions.......................89Acknowledgement............................90Publishedpapers...................91Englishpapers..........................93EnghshPers93一●●山东大学博士学位论文目的丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤的保护作用研究博士研究生王英燕专业儿科学导师孙若鹏教授中文摘要早产儿脑白质损伤whitematterdamage,1j|『MD是目前早产儿脑损伤的最主要类型,是早产儿死亡及运动智能发育障碍的主要原因之一,严重影响患儿的生存生活质量。脑白质的主要成分为神经纤维及神经胶质细胞,包括少突胶质细胞oligodendrocyte,OL、星形胶质细胞、小胶质细胞。孕龄2432周是wMD发生的高峰期,此时晚期OL前体细胞和未成熟0L是脑室周围白质的主要细胞群,对各种损伤性攻击具有明显易损性,研究证实晚期0L前体是白质损伤发生的主要靶细胞。缺血和感染是导致新生儿WMD的两大主要原因,最终病理结果均为白质0L的损伤与丢失。对新生儿缺血缺氧性脑损伤的治疗,目前国内外尚无统一、有效的治疗方案,探寻更有效的治疗方法己成为围产医学中的重要课题。丙酮酸乙酯ethylpyruvate,EP是一种安全、稳定且极易被细胞摄取的物质,已在动物实验中被证实具有较强的抗炎和自由基清除作用。研究表明,丙酮酸乙酯具有一定的神经保护作用,但有关于其在白质损伤中的作用及机制研究尚无报道。本试验在未成熟大鼠制备的脑缺血缺氧损伤动物模型基础上,研究丙酮酸乙酯对缺血缺氧所致白质损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法将3日龄P3SD未成熟新生大鼠随机分为三组对照组、缺血缺氧组HI组、丙酮酸乙酯干预组HIEP组。对照组仅切开颈部皮肤缺血缺氧组结扎右侧颈总动脉伴缺氧环境6%0260min丙酮酸乙酯干预组建立新生大鼠脑缺血缺氧模型,于缺血缺氧后10min、1h、24h分别三次给予丙酮酸乙酯山东大学博士学位论文50mg/kg腹腔注射,体内评估丙酮酸乙酯对白质损伤的保护作用。1.新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤及丙酮酸乙酯的干预作用研究对照组、HI组、HIEP组分别于术前、术后1天、3天、5天、7天、10天、14天固定时间点测量幼鼠体重,比较各组幼鼠的生长发育情况在模型建立后2天、6天、14天,通过组织切片HE染色观察新生大鼠缺血缺氧后脑白质损伤的病理变化应用免疫组化方法对不同发育阶段的晚期少突胶质前体、未成熟0L、成熟0L标志物进行检测,观察缺血缺氧后0L的损伤情况及丙酮酸乙酯的作用。2.丙酮酸乙酯对新生大鼠缺血缺氧后脑内炎症反应的作用研究缺血缺氧后2天、6天,应用免疫组化分别对星形胶质细胞标志物、小胶质细胞标志物进行检测,观察两种炎性细胞的激活情况缺血缺氧后6小时、24小时、2天、6天,分别提取各组新生大鼠脑组织蛋白,应用酶联免疫吸附实验Elisa检测肿瘤坏死因子一aTNFa、白细胞介素一l6IL一1B的表达情况。3.丙酮酸乙酯在新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤保护中的抗凋亡作用缺血缺氧脑损伤后48h,应用免疫荧光双标检测幼鼠脑内少突胶质细胞凋亡情况,应用Westernblot检测各组幼鼠脑室周围白质内cleavedcaspase3、Bax、Bcl一2的蛋白表达水平,并进行相关性分析。结果1.丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤具有显著保护作用1丙酮酸乙酯提高了新生大鼠缺血缺氧后的成活率对照组幼鼠饮食、活动均正常H工组新生大鼠死亡率28.32%,出现不同程度的异常反应丙酮酸乙酯干预组死亡率降为16.84%。2丙酮酸乙酯改善了幼鼠缺血缺氧脑损伤后的生长发育情况术前各组新生大鼠体重无显著性差异P0.05,缺血缺氧后1天至2周幼鼠体重增长速度较对照组明显缓慢PO.05,丙酮酸乙酯干预使幼鼠的体重生长速度显著增快PO.01。3不同时间点组织切片HE染色可见对照组脑白质结构正常,染色清晰缺血缺氧后新生大鼠脑白质细胞水肿、结构疏松、纤维紊乱,后期炎性胶质细胞增生活化,脑室扩大明显,可出现软化灶。丙酮酸乙酯显著改善了缺血缺山东大学博士学位论文氧后脑白质病理变化、抑制了侧脑室的扩大程度。4晚期0L前体、未成熟0L在缺血缺氧后明显损伤,数量较对照组显著减少PO.01,同时髓鞘相关蛋白表达亦显著减少PO.01,出现低髓鞘化。丙酮酸乙酯干预显著减轻了缺血缺氧导致的不同发育阶段0L的损伤与丢失,改善了白质区域的髓鞘化程度P0.01。2.丙酮酸乙酯减轻了新生大鼠缺血缺氧后脑内的炎症反应水平1新生大鼠缺血缺氧后2天、6天脑内小胶质细胞、星形胶质细胞显著激活,活化细胞数量明显增多PO.01,丙酮酸乙酯有效抑制了不同时间点两种炎症反应细胞的活化增生P0.01。2对照组新生大鼠脑内存在少量的TNFQ、IL1B表达缺血缺氧后6小时新生大鼠脑内TNFQ表达水平即开始上调,2天后较对照组有更显著升高,直到缺血缺氧后6天仍维持在较高的水平,较同日龄对照组比较差异均有显著意义P0.01,丙酮酸乙酯显著降低了幼鼠脑内不同时间点TNFa的表达水平PO.05ILI13的表达水平于缺血缺氧后6小时、24小时、2天、6天亦呈逐渐升高趋势PO.01,丙酮酸乙酯使各时间点ILIB的表达显著下降PO.01。3.丙酮酸乙酯在新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤保护中的抗凋亡作用1免疫荧光双标结果显示,缺血缺氧后2天脑室周围白质少突胶质细胞前体存在明显凋亡,凋亡细胞数量较对照组明显增多PO.01,丙酮酸乙酯使凋亡细胞数量显著减少PO.01。2新生大鼠缺血缺氧脑损伤后白质内凋亡因子caspase一3显著激活P0.01,腹腔注射丙酮酸乙酯降低了caspase一3的激活水平P0.01。3丙酮酸乙酯对促凋亡蛋白Bax的作用新生大鼠脑缺血缺氧损伤后白质Bax蛋白表达水平较对照组明显升高PO.01,丙酮酸乙酯干预使Bax表达水平显著降低P0.01。4丙酮酸乙酯对抗凋亡蛋白Bcl一2的作用新生大鼠脑缺血缺氧后白质Bcl一2表达水平显著降低P0.01,丙酮酸乙酯明显升高了脑损伤后Bcl一2的表达水平PO.01。5Bax/Bcl2值与0L凋亡呈正相关山东大学博士学位论文相关性分析显示同一时间点,缺血缺氧后新生大鼠脑白质内Bax/Bcl一2值增高与OL凋亡增多成正相关性。丙酮酸乙酯显著降低了缺血缺氧后Bax/BC一2值,对OL细胞凋亡起保护作用。结论1.本实验成功建立了3日龄未成熟新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤模型,该模型以少突胶质细胞前体损伤为主、与人类早产儿脑室周围白质损伤病理相似。2.丙酮酸乙酯对未成熟大鼠缺血缺氧所致白质损伤具有显著的保护作用,能改善缺血缺氧后幼鼠的生长发育情况。3.丙酮酸乙酯抑制脑缺血缺氧后炎症反应细胞的激活、降低其调控的炎症因子的表达水平,抗炎作用参与了丙酮酸乙酯的白质损伤保护作用。4.凋亡是缺血缺氧少突胶质细胞损伤的重要机制,丙酮酸乙酯具有显著的抗凋亡作用,可抑制促凋亡因子的产生,升高抗凋亡因子的表达水平。5.该研究为临床治疗早产儿缺血缺氧性白质损伤提供丰富的动物实验信息及依据,为进一步研究早产儿白质损伤的防治提供了可能的干预手段和理论依据。关键词缺血缺氧白质损伤少突胶质细胞丙酮酸乙酯炎症反应凋亡4山东大学博士学位论文ProtectiveEffectofEthylPyruvateonHypoxiaIschemiaInducedWhiteMatterInjuryinObjectiveImmatureRatBrainABSTRACTWhitematterdamage,asthepredominantformofcerebralinjuryinprematureinfants,istheleadingcauseofneurodevelopmentalimpairment.Itconsiderablycontributestoneonatalmortalityandlongtermneurologicaldeficits.Theupstreampathogenesisofwhitematterdamageismainlyrelatedtohypoxia。ischemiaHIandinfection/inflammationinsickprematureinfants.Premyelinatingoligodendrocytehasbeenconfirmedtobethemaintargetcellofwhitematterinjury.Unfortunately,thereiscurrentlynopromisinginterventionforwhitematterinjuryinpretermneonates.EthylpyruvateEP,astablederivativeofpymvate,hasbeenshowntobetherapeuticallyeffectiveinaseriesofexperimentalmodels.Itsneuroprotectiveeffectshavealsobeeninvestigated.Nonetheless,theinfluenceofEPonoligodendrocytesinneonatalwhitemattedamageafterhypoxiaischemiaisstillunknown.ThisstudywasdesignedtoassesswhetherEPadministrationcouldprotecttheneonatalratbrainfromwhitematterdamage,usingapostnatalday3ratmodelofpretermhypoxiaischemia.AndthepotentialmechanismsunderlyingtheeffectsofEPwerealsoevaluated。MethodsThestudywasconductedonpostnatalday3P3prematureratpups.RatswereallocatedrandomlyintothreegroupscontrolgroupHIgroupfightcommoncarotidarteryligationand6%02for60minandHIEPgroup50mg/kg,intraperitoneally,injected10min,1hand24hafterHIinsult.Examinationofbodyweightwasstartedfrompostnatalday3andWascarriedoutuntilpostnatalday17.HEstainingWasused5
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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