专题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

,课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,1,课题背景,1.尿素的利用:尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。,2.细菌利用尿素的原理：,CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,细菌脲酶,课题目标,1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,尿素分子的立体结构,一、研究思路,（一）筛选菌株,1.实验室微生物的筛选原理,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,本课题使用的培养基KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 .7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。,2.选择培养基,问题1：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？,问题2：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。,加入青霉素的培养基,（1）概念：,（2）例子：,细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。,不加含碳有机物的无碳培养基,分离自养型微生物。,4,（二）统计菌落数目,1.显微镜直接计数,(1)原理:利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。,(2)具体做法：,（3）优缺点：,缺点：不能区分死菌和活菌。,优点：能准确统计微生物的实际数目。,每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。,以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，一个大方格中的总菌数是多少?,5A,1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）,5AB104,1mm,5,2.间接计数（活菌计数法）,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(m)，M代表稀释倍数。,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,（2）原理：,稀释涂布平板法。,（1）常用方法：,计算公式：,每克样品中的菌落数(CV)M,【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（ ） A.2.34108B.2.34109 C.234D.23.4,（3）计数,【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1106=2.34109。,B,6,【例2】：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。,乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。,【方法点拨】,为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。,为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。,统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,稀释涂布平板法计算注意事项,7,1.目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,设置对照,2.实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学结果有问题，可能是A同学培养基被杂菌污染，或者培养基混入其他含氮物质，导致其他杂菌生长。,但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响因素吗？,方案1：其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,方案2：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,8,土壤中分解尿素的细菌的分离与记数,1.土壤取样,3.样品稀释、取样涂布,4.微生物的培养、观察并记录结果,5.细菌的计数,二、实验设计,1.土壤取样,从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。,选用稀释倍数为103107的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。,9,3.样品稀释、取样涂布,测定土壤细菌数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释液；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释液。,因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。,注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。,10,4.微生物的培养、观察并记录结果,将涂布好的培养皿放在30下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。,不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在3037的温度下培养12d；放线菌一般在2528的温度下培养57d；而霉菌一般在2528的温度下培养34d。,一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落形状、大小、隆起程度和颜色。,11,12,5.细菌的计数,当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,【课堂小结】,一、选择培养基的成分：,分解尿素细菌的分离与计数,尿素作为唯一的氮源。,二、鉴定方法：,在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素。,三、统计菌落数目的方法,（1）显微镜直接计数法,（2）间接计数法（稀释涂布平板计数法）,计算公式,每克样品中的菌株数(CV)M,操作：设置重复组，选择菌落数30300的平板进行计数。,（3）设置对照,证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。,证明选择培养基的选择作用：用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。,13,【课堂练习】,下面关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述中，正确的是()A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素B.筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质C.统计样品中的活菌数目时一般用平板划线法D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌,A,【方法点拨】1.筛选分解尿素的细菌的实验中，采用的是以尿素为唯一“氮源”的培养基。,2.统计样品中的活菌数目一般用稀释涂布平板法。,3.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，这样就能初步鉴定该种细菌能够分解尿素。,14,(一)无菌操作,1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。,2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。,3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。,(二）做好标记,注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。,（三）规划时间,三、操作提示,15,【典型例题】,下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，不正确的是()A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高压蒸汽灭菌后倒平板B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL涂布到不同平板上培养C.将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数,D,【方法点拨】一般选择菌落数在30300间的平板进行计数,16,四、结果分析与评价,（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选菌落。,对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已经筛选出一些菌落。,（二）样品的稀释操作是否成功。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 300平板，说明稀释比较成功，并能够进行菌落的计数。,（三）重复组的结果是否一致。,如果选取的是同一种土样，统计结果应该相近。如果结果相差太