多糖的分离纯化及性质表征

多糖的分离纯化及结构表征,员工培训2012-7-31,1、多糖的基本概述,多糖，又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的链状聚合物。 (C6H10O5)n， n10,1、多糖的基本概述,组成分类,同多糖：由一种单糖组成（淀粉、半纤维素、几丁质等）,杂多糖：由两种或两种以上单糖组成（透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等）,1、多糖的基本概述,单糖组成,1、多糖的基本概述,多糖的表征无还原性。大多难溶于水，溶于水后形成胶体溶液。有旋光性，但没有变旋现象。无甜味。在酸或酶的作用下水解成单糖和寡糖。分子量在数万到数百万之间,1、多糖的基本概述,多糖广泛分布于自然界高等植物、微生物（细菌和真菌）、地衣、海藻和动物体内。,1、多糖的基本概述,愈来愈多的研究发现, 人的生命过程几乎都与糖链有关:细胞间通讯、识别和相互作用细胞的运动和粘附病原与宿主细胞的作用 糖链携带着生物信息. 它在细胞表面的分子识别过程中起着决定性作用. 大量研究证明许多多糖具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒和保护胃肠系统等多种生物活性,2多糖的提取分离,多糖存在形式： 细胞壁外-胞外多糖 细胞壁内-胞内多糖（大多数多糖） 细胞壁多糖动植物的细胞大多由脂质包围，用机械粉碎后还必须脱脂（沙氏提取器，乙醇回流）。对于含有较多单糖和低聚糖的样品可用热的80%乙醇处理。,2多糖的提取分离,原料,前处理,提取,过滤或离心,醇沉,脱蛋白,脱色,透析,沉淀,滤渣,滤液,柱层析,多糖,2.1材料的预处理,根据不同原料性质，对一些样品进行粉碎处理，含脂高应先脱脂，含色素高需进行脱色，通常采用丙酮、乙醚、乙醇进行预处理以达到脱脂或脱色的目的。对于含有较多单糖和低聚糖的样品可用热的80%乙醇处理。,2.2多糖的提取方法,热水浸提法大多数多糖在热水中溶解度较大且性质稳定。得率应考虑提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。水提醇沉是多糖提取最常用方法。,多糖为非极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱溶液或氯化钠水溶液做提取溶剂。,2.2多糖的提取方法,稀酸提取法1%醋酸酸性条件引起多糖中糖苷键的断裂，尽量避免在酸性条件提取多糖。提取时间宜短、提取温度低。,2.2多糖的提取方法,稀碱提取法0.1-1M氢氧化钠（钾），如几丁质提取用5%氢氧化钠去杂质。碱提多糖时易发生美拉德反应，可通过前处理去除小分子糖、避免pH值处在8-10范围、避免提取温度在60-80。通氮气或加入硼氢化钠（钾）,2.2多糖的提取方法,微波辅助提取法利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中。,2.2多糖的提取方法,超声辅助法提取法利用超声波的空化作用产生的压力造成被破碎物质在瞬间破碎，加速效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。,与常规提取方法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点。常用于辅助提取细胞内物质。,2.2多糖的提取方法,酶法酶解反应较温和将组织分解，增加多糖的溶出，可较大幅度提高产率。,常用于除去各种与多糖结合的结合蛋白质。,2.3多糖提取液浓缩,多糖提取液浓缩应尽量在低温下进行，并防止提取物与氧气接触，防止多糖被氧化，保持原有结构及生物活性。,吸附法干葡聚糖凝胶加入提取液中，两者比例为1:5.由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右，多糖回收率达80%。,2.3多糖提取液浓缩,超滤法在一定压力下，小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到部分的纯化。,2.3多糖提取液浓缩,透析法把装有提取液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇或甘油中，提取液中水分通过透析袋到吸水剂中，从而达到浓缩效果。,真空浓缩通过真空泵抽真空，使水的沸点降低而从提取液中蒸发出来，而多糖成分不受破坏。,2.3多糖的沉淀,沉淀法是分离生物活性物质的传统方法，在生物活性物质提取中常用于初步分离。,有机溶剂沉淀法在提取液中加入与水互溶的有机溶剂，使系统介电常数减小，多糖溶解度减小而发生沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等。,2.5脱蛋白,粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去。多糖的分离纯化主要包括脱蛋白、脱色、脱盐和除去小分子杂质,2.5脱蛋白,采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理，但用酸性试剂宜短，温度宜低，以免多糖降解。,2.5脱蛋白,沙维积法（Savage法）蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶于水，将多糖水溶液、氯仿、正丁醇之比调为25:5:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿正丁醇生成凝胶物而分离，然后离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。效率低，常加入蛋白酶后采用Savage法,2.5脱蛋白,三氟三氯乙烷法多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌10min左右，离心得上面水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液。易挥发，需在低温条件下进行,2.5脱蛋白,三氯醋酸法在多糖水溶液中滴加5-30三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5-10放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。反应较为剧烈，易引起糖降解,2.5脱蛋白,酶解法在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉菌蛋白酶等，使样品中的蛋白质降解，经透析后得到基本无蛋白和小分子的多糖。通常将其与Savage法综合使用除蛋白质效果较好。,2.5脱蛋白,盐酸法取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其pH至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀，即脱去蛋白质。,2.5脱蛋白,脱蛋白效果的检测方法1.除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经除尽。2.茚三酮反应检测，结果呈阴性表明蛋白基本除去。,2.6脱色,活性炭脱色活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。,活性炭脱色效果同活性炭类型、活性炭用量、脱色温度及pH值等相关。,2.6脱色,弱碱性离子交换树脂植物来源的多糖，常含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA-7来吸附色素。,2.6脱色,大孔吸附树脂柱层析,2.6脱色,氧化脱色对于与糖结合型的色素，易被DEAE纤维素修复，不能被水洗脱，可进行氧化脱色。以浓氨水或NaOH液调至pH8.0左右，50以下滴加H2O2至浅黄色，保温2小时。（氧化色素同时，造成多糖的降解）,2.6脱色,脱色方法的选择活性炭脱色：适用于大量制备性分离，同时吸附一定的多糖，造成多糖的损失。树脂脱色：适用于植物来源的多糖发酵来源的多糖颜色一般较浅，色素含量较少，一般可不除色素,2.7除去小分子杂质,透析利用溶液浓度扩散效应，将分子量小的物质如无机盐、低聚糖、氨基酸等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中，不断换水即可保持浓度差，从而除尽小分子杂质。,2.7除去小分子杂质,超滤以特殊的超滤膜为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力，将不同分子量的物质进行选择性分离。,2.8干燥,干燥将已透析的多糖溶液依次用无水乙醇、丙酮、乙醚进行洗涤，洗涤后的多糖60真空干燥或冷冻干燥得精制多糖。,多糖的纯化,由于提取的精制多糖为含有多种组分的多糖混合物，因此需要进一步纯化。用于大分子多糖及多糖类复合物的分离纯化方法有分步沉淀法、金属络合物法、离子交换法、柱层析法等。,多糖的纯化,分步沉淀法根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。,多糖的纯化,金属络合物法根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合物而沉淀的性质进行多糖的纯化。常用的络合剂有氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。得到的络合物沉淀经水充分洗涤后,用酸分解, 得到游离的多糖。,多糖的纯化,盐析法根据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具有不同溶解度的性质分离各种多糖。在多糖中加入中性盐( 如NaCl、KCl、(NH4)2SO4 等) 至一定浓度, 则在该盐浓度时溶解度最小的多糖便沉淀析出,然后上清液继续加盐至更高浓度,则另一多糖又沉淀析出。,多糖的纯化,柱层析法柱层析方法是目前多糖中应用最多的方法, 原因是效果好, 操作简单。主要包括：纤维素柱层析、阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析法等。,多糖的纯化,多糖的纯化,多糖的纯化,季胺盐沉淀法根据长链季胺盐能与酸性多糖或长链高分子量多糖形成络合物, 在低离子强度的水溶液中不溶解的特性, 使其沉淀析出, 然后增加溶液的离子强度到一定范围, 络合物则逐渐离解, 最终溶解。,多糖的纯度鉴定,多糖纯度鉴定方法超速离心法、电泳法、比旋光度法及凝胶色谱法。,多糖的纯度鉴定,超速离心法（Ultra-centrifugal method）微粒在离心力场中的移动速度与微粒的密度、大小与形状有关。分子密度、大小和形状的微粒在离心力场作用下形成单一区带。,不能完全将溶液中相对分子质量不同的分子分开，使用具有一定的局限性,多糖的纯度鉴定,电泳法（Electrophoresis）多糖在电场作用下，按其分子大小、形状和所带电荷的不同而移动不同的距离。若为纯品，电泳后会得单一斑点。,较常用，目前主要有醋酸纤维薄膜电泳、高压电泳法、聚丙烯凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳等,多糖的纯度鉴定,比旋光度测定法不同的多糖具有不同的比旋度，同时在不同的低级醇中有不同的溶解度。在一定浓度的低级醇中，分子量大的较分子量小的溶解度小。因此，不同浓度的低级醇中得到的多糖沉淀的比旋度相同，则证明该多糖为均一组分。,受溶液的温度、浓度特别是微量成分的改变而影响较大。,多糖的纯度鉴定,凝胶色谱法凝胶具有一定孔径大小，不同形状和大小的多糖分子在凝胶层析柱中移动的速度不同，较大分子移动较小分子快，流出液经示差检测器检测，如果只有一个对称峰，则表明为均一组分。,快速、高分辨率和重现性好，最为常用。,多糖的结构表征,初级结构 一级结构：糖基的组成、糖基的排列顺序、相邻糖基的连接方式，异头碳构型一级糖链有无分支，分支的位置和长短等。高级结构 二级结构：多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象 三级结构：以二级结构为基础，由于糖单位羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象 四级结构：多聚链间非共价键结合形成的聚集体,多糖的结构表征,组成单糖种类与数目不相同，多糖的结构非常复杂多糖结构复杂，其研究主要包括以下内容：1.相对分子质量2.单糖的种类与物质的量比3.各糖环的构象( 呋喃型或吡喃型)与异头碳构型4.糖残基间的连接方式5.二级结构及空间构象,多糖的结构表征,1.多糖相对分子质量测定常用的方法有凝胶色谱法、蒸汽压渗透计法、端基法、粘度法、光散射法、渗透压法和超滤法等。凝胶色谱法是比较常用的方法，用已知分子量样品作标准，建立标准曲线，求得待测多糖的相对分子质量。多糖相对分子质量只代表相似链长的平均而不是确切的分子大小。往往用不同的方法会得到不同的相对分子质量。,多糖的结构表征,2.化学分析法酸水解鉴定多糖的单糖组成常用的方法。甲基化法阐明单糖的连接方式(键型)、重复结构中某种单糖的数目、末端糖的性质及分支点的位置等。过碘酸氧化确定多糖中各种单糖的键型及其比例。Smith降解阐明多糖中单糖的部分连接顺序和键型。,多糖的结构表征,3.物理分析方法紫外光谱法检测多糖中是否含有蛋白质、核酸、多肽类。红外光谱法确定吡喃糖的苷键构型及常规观察其他官能团。气相色谱法