内毒素及β-葡聚糖检测

内毒素和1，3-D-葡聚糖检测的临床应用,主要内容,来源及结构,生物学活性,检测的临床应用,检测方法及参考范围,标本采集及影响因素,内 毒 素,内毒素的生物学活性,内毒素的结构,特异性多糖,核心多糖,类脂A,内毒素概述,内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖（LPS），这些成分只在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或活菌以发泡形式将其释出。,内毒素的有益作用,内毒素血症产生原因,有效的抗菌治疗后，细菌崩解,输入了含有细菌的药物、血液或者体液等。,各类疾病内毒素血症的发生率,肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、烧伤85%、急性胰腺炎90%、败血症70%、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎58-100%、丙肝60%、胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%、多器官功能衰竭100%。,内毒素检测的临床应用,内毒素检测在医院中的应用,内毒素血症的临床症状,内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、缺氧及酸中毒等。 最严重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率极高。,内毒素的检测方法,鲎试验是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断试剂中细菌内毒素含量的一种方法。,内毒素的检测方法,1.凝胶法：鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法2.浊度法：利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量3.比色法：利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量4.流式细胞术：测内毒素的量而不是活性5.化学发光测定法,内毒素的检测原理,革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒（光度法）检测原理：革兰阴性菌脂多糖能激活酶反应主剂中的C因子、B因子、凝固酶原等，引起凝固蛋白原转变成凝固蛋白从而引起吸光度变化，根据检测其溶液吸光度变化对革兰阴性菌脂多糖浓度进行测定。,MB-80微生物快速动态检测系统,内毒素检测的参考值,检测值10pg/ml,阴性。检测值介于1020pg/ml之间，临床观察期，建议动态采血检测。检测值20pg/ml，阳性，建议临床结合症状进行治疗。,检测方法的局限性,只能检测革兰阴性菌脂多糖含量，不能区分细菌种属。,检测样本的采集与保存,检测样本：血液采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管（肝素类抗凝）。常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患者透析前采血）。样本保存：样本采集后应在3000转/分进行离心，若不能及时检测，应将血浆转移至无热原试管内，在-30冰箱中冷冻保存，一周内使用。特殊标本处理 ：对一般黄疸、溶血、乳糜血标本，稀释2-5倍后进行检测 ；对于严重的黄疸、溶血、乳糜血标本，应重新采血。,干扰因素,1.应用某些抗生素如-酰胺内酯类、喹诺酮类等患者；2.一些蛋白：阳离子蛋白如溶菌酶、核糖核酸酶A及人免疫球蛋白G均能与内毒素形成细菌内毒素-蛋白复合体，对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，而影响测定内毒素结果；3.操作环境及操作过程中的污染，可能造成假阳性。,(1-3)-D-葡聚糖,1-3-D-葡聚糖本质及特点,(1-3)-D-葡聚糖特性,1.对热极为稳定，高压21并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G试验灵敏。2.当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。3.在浅部真菌感染中，(1-3)-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。,侵袭性真菌感染的定义,侵袭性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)定义: 指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性较大。,侵袭性肺部真菌感染,侵袭性真菌感染的发病率逐年上升,其中又以侵袭性肺部真菌感染最常见,大约占50%60%。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可高达30% 80% 。,侵袭性肺部真菌感染,临床表现：缺乏特异性,多表现为发热、咳嗽、咳痰、咳血、胸闷、呼吸困难等。 现状：两高两低一快 高院内感染率和病死率，低临床和实验 室诊断率，患者病情恶化快。 （检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高。）,侵袭性真菌感染的诱因,内源性诱因： 影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等。外源性诱因： 广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂； 插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植； 免疫缺陷综合症。,侵袭性真菌感染诊断困难的原因,诊断困难的主要原因：临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者的病情所限难以实施真菌检测项目开展相对不足或滞后,侵袭性真菌感染的特点,不产生内毒素和外毒素，致病机理不明；致病力一般较弱，机体免疫低下时发生；感染菌种变化：白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增长趋势上升明显；早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。,主要可引发侵袭性真菌感染的疾病,呼吸系统疾病：肺炎、肺纤维症感染及寄生虫病：肺结核、腹腔内脓肿、AIDS循环系统疾病：脑出血、脑梗塞、硬膜下血瘤术后、胸部大动脉瘤术后内分泌疾病：糖尿病血液及造血器官疾病：再生障碍性贫血、DIC肿瘤类：胃癌，肝癌，肝内胆管癌，肺癌，多发性骨髓瘤，白血病，恶性淋巴瘤,“G”试验,1-3-D-葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。,G试验检测评价,BG值在侵袭性真菌感染临床表现出现之前就已经高于正常值相关报道5例确诊IFI及3例临床诊断的IFI患者，发现BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部CT检查发现以前 。平均早于发热5d早于呼吸道症状10d,G试验临床应用,1明确诊断（抗真菌药物治疗前）2治疗效果监测（抗真菌药物治疗后）3连续2次采血进行G试验,侵袭性真菌感染的临床检测方法,直接培养真菌法-敏感性低，耗时长, 培养阳性率低。培养结果是定性的，有些标本采集困难G试验：通过检测(1-3)-D-葡聚糖的含量，判断是否有真菌感染。耗时短，灵敏度高，特异性强，定量检测可判断感染严重程度PCR技术：真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检测,真菌1-3-D葡聚糖检测原理,真菌1-3-D葡聚糖检测试剂盒（光度法）检测原理：真菌1-3-D葡聚糖能特异性激活反应主剂中的G因子、凝血酶原等，发生酶的级联反应从而引起吸光度变化，根据检测其溶液吸光度变化对真菌1-3-D葡聚糖浓度进行定量。 试剂中添加的两性电解质甘氨酸、氨基糖苷类抗生素及表面活性剂可抑制脂多糖对B、C因子的激活，对革兰阴性菌脂多糖有特异性屏蔽作用。,MB-80微生物快速动态检测系统,真菌1-3-D葡聚糖参考值,检测值60pg/ml,阴性。检测值介于60100pg/ml之间，临床观察期，建议动态采血检测。检测值100pg/ml，阳性(深部真菌感染)，建议临床结合症状进行治疗。,检测方法的局限性,只能检测真菌1-3-D葡聚糖的含量，不能区分真菌种属，不能检测结合菌和隐球菌。,内毒素与-葡聚糖的检测比较,已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和真菌1-3-D葡聚糖，但它们的反应曲线不一样。内毒素反应曲线为S型特征曲线，而-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。,念珠菌显色培养基的菌落颜色,对于念珠菌血症, G试验检测是首选检查热带念珠菌-灰蓝色白色念珠菌 -绿色克柔念珠菌-粉红色光滑念珠菌-紫红色,标本采集及保存,检测样本：血液、肺细胞灌洗液采集要求： 1.采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管； 2.常规病人早上用药治疗前空腹采血，血透析患者透析前采血,标本采集及保存,及时送检，及时检测：2-3h内检测不合格标本：严重黄疸、溶血、乳糜标本会影响测结果，需重新采血进行检测。,干扰因素,据报道可能产生假阳性的原因有： 1.应用纤维素膜进行血液透析患者; 2.某些纱布或其他医疗物品中含有葡聚糖; 3.静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白）等含有葡聚糖;,干扰因素,4.某些细菌败血症患者（尤其是链球菌败血症）; 5.抗肿瘤类药物(香菇多糖、裂殖菌多糖); 6.磺胺类药物; 7.蘑菇类食物;,临床细菌内毒素及(1-3)-D-葡聚糖检测的国内外发展,国外：血液（包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁等）中内毒素以及(1-3)-D-葡聚糖微量定量检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用细菌内毒素及(1-3)