新型PCR检测技术

第15讲,新型PCR检测技术,回顾上节课所学PCR,五个要素模板：单链或双链DNA引物：16-30 bp合成的寡核苷酸DNA聚合酶：耐热的Taq底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP)液态反应体系：其中Mg2+是DNA聚合酶的激活剂,基本程序94 30s 变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）72 n(按1扩增1kb计算）延伸 25-35个循环,基本内容,一、多重PCR二、荧光定量PCR的原理三、实时荧光定量PCR的原理四、实时荧光定量PCR与常规的PCR的差别五、实时荧光定量PCR的应用六、课堂小结七、作业,一、多重PCR,1、定义： 它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。 区别在多对引物需要设计。,2、多重PCR的步骤：多重PCR扩增区域的选择。多对引物的设计。反应条件的选择及反应体系的优化（引物浓度、模板浓度、dNTP及酶的浓度、Mg2+浓度、加入DMSO、甘油或者BSA、PCR循环参数的设定）。结果分析,一、多重PCR,一、多重PCR,3、多重PCR的特点高效性 在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。系统性 多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。经济简便性 多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。,一、多重PCR,4、多重PCR的应用（5个实例）例一 肝炎病毒的感染，在同一病人体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染。有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠.,一、多重PCR,4、多重PCR的应用（5个实例）例二 肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病.,一、多重PCR,4、多重PCR的应用（5个实例）例三 性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断. 战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检. 需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.,一、多重PCR,4、多重PCR的应用（5个实例）例四 某些遗传病及癌基因的分型鉴定。遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位 ，通过常规PCR很难检测出来。例五 植物种质鉴定、植物病毒的检测、分子育种、快速检测外源基因的整合状态。,一、多重PCR,二、荧光定量PCR的原理,荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。,二、荧光定量PCR的原理,荧光定量PCR最常用于基因表达产物的分析，即将转录生成的单链mRNA逆转录成双链的cDNA,以此cDNA为模板进行反应。（动画）,荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。1、 荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。,二、荧光定量PCR的原理,1、荧光探针,二、荧光定量PCR的原理,1、荧光探针,二、荧光定量PCR的原理,1、荧光探针,二、荧光定量PCR的原理,1、荧光探针,二、荧光定量PCR的原理,1、荧光探针,二、荧光定量PCR的原理,2、荧光染料 在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,二、荧光定量PCR的原理,2、荧光染料,二、荧光定量PCR的原理,2、荧光染料,二、荧光定量PCR的原理,观看视频动画,荧光探针特异性高探针设计要求高合成费用高多重PCR检出,荧光染料简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR,二、荧光定量PCR的原理,3、荧光探针和荧光染料的区别,荧光探针SNP解析病毒、病原菌的检测,荧光染料mRNA表达量分析,二、荧光定量PCR的原理,4、荧光探针和荧光染料的用途,三、实时荧光定量PCR的原理,1、Ct 值 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 - Ct值。 C代表Cycle，t代表threshold（临界值）。 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 。,2、Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。,三、实时荧光定量PCR的原理,三、实时荧光定量PCR的原理,Ct,起始拷贝数或起始浓度,标准曲线,三、实时荧光定量PCR原理,3、数据测定 在实时荧光定量PCR的反应体系中，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。 再利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。,三、实时荧光定量PCR原理,3、数据测定,三、实时荧光定量PCR原理,3、数据测定,Rn (荧光信号),循环数Cycle Number,三、实时荧光定量PCR原理,3、数据测定,操作过程,四、实时荧光定量PCR与常规PCR的差别,2、分析对象的差别：,1、原理的差别：动画视频,四、实时荧光定量PCR与常规PCR的差别,3、使用仪器及结果输出形式的差别：,五、实时荧光定量PCR的应用,1.病原体检测 2.产前诊断 3.药物疗效考核 4.肿瘤基因检测 5.新药开发研究 6.超早期感染用药物及疗法的研究与开发,1、病原体检测,目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。,五、实时荧光定量PCR的应用,2、产前诊断,到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生。 如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。,五、实时荧光定量PCR的应用,3、药物疗效考核,比如，对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感。,五、实时荧光定量PCR的应用,癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。 目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。,五、实时荧光定量PCR的应用,4、肿瘤基因检测,5、新药开发研究,针对一些感染性疾病的药物，如各种病毒病、细菌病等，在新药的开发过程中，快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金，与以前所用的常规方法相比，实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量，因此有利用分析药物的作用效果，为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。,五、实时荧光定量PCR的应用,6、超早期感染用药物及疗法的研究与开发,实时荧光定量PCR方法测