Nrf2缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能

Nrf2缺陷损害小鼠食管黏膜的屏障功能,冬威敏建,内容,验证Nrf2参与食管黏膜的屏障功能，在抵抗胃食管反流病中发挥保护作用,目的,人食管样品获取、小鼠手术模型的建立； 测定跨膜电阻； 食管黏膜超微结构变化的镜检； 食管黏膜ATP含量测定； 基因芯片、免疫组化、Western杂交和染色质免疫共沉 淀评价基因表达,实验设计,Nrf2缺陷通过破坏依赖能量的紧密连接而损害食管屏障功能,结论,食管黏膜屏障功能,黏膜屏障系统由3部分组成： 上皮前屏障包括表面黏液层（作用低到可以忽略），不移动水层和上皮细胞分泌的碳酸氢根离子； 上皮屏障包括多层磷状上皮细胞膜、细胞间连接复合物（紧密蛋白、糖蛋白机制和缓冲剂）、细胞内缓冲剂、和膜离子转运蛋白； 上皮后屏障包括血液流动和酸碱平衡,细胞质,1,（Nfe2L2，红细胞衍生核因子2样蛋白2）属于转录因子CNC家族，含有亮氨酸拉链结构（bZip结构），调节解毒和抗氧化应激相关酶的表达，是一种主要的细胞防御途径,Nrf2蛋白,Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1，一种与胞浆肌动蛋白结合的含624个氨基酸的多肽，是细胞氧化应激反应中的重要调控因子,细胞核内重要的转录因子，可调节细胞内各种蛋白的表达、细胞分化和凋亡，同样含有bZip结构的。大Maf蛋白可以直接活化相应基因，小Maf蛋白必须与其他具有转录活性的bZip蛋白结合，形成异源二聚体促进基因转录，或自身形成同源二聚体抑制基因转录,Keap1蛋白,小Maf蛋白,正常生理条件,氧化应激或外源物质刺激,细胞核,ARE,Nrf2信号通路在小鼠食管黏膜发育的成熟阶段被激活。在这个阶段，角质化的复层磷状上皮持续变厚，最后形成成人的食管黏膜。由于角质化层是主要的抵抗物理应激和化学损伤的保护层，末端分化角质化细胞表达能够通过淬灭活性氧来提供保护作用的蛋白，故推测Nrf2可能参与食管黏膜屏障功能，可能在胃食管反流病中发挥保护作用。,实验设计,人类食管活检样品 采样人排除条件；10副正常人和非糜烂性胃食管反流病患者的活检组织样品；在胃镜检查期间从（食管）5cm近端到胃食管连接处获得的。动物手术模型的建立 8周龄的野生型和Nrf2缺陷型C57BL/6J小鼠，每组5只。麻醉之后通过上中线切口进行吻合手术。食管胃吻合手术的目的是消除括约肌功能，允许自由的胃液反流，建立胃反流模型；食管胃十二指肠吻合术加胃切除术是为了获得十二指肠反流模型；食管胃十二指肠吻合术是为了获得混合反流模型。吻合手术之后，清洗腹腔，用6-0丝线缝合腹腔。,十二指肠,食管胃吻合术：在食管远端和前胃处作3个越5mm切口，然后精确地黏膜对黏膜纵向缝合。,食管胃十二指肠吻合术：在食管和十二指肠上作2个5mm切口，然后精确的黏膜对黏膜缝合。,食管胃十二指肠吻合术加胃切除术：除了食管胃十二指肠吻合术，在胃食管连接处和幽门处结扎后切除胃部。,实验设计,测跨膜电阻：食管黏膜组织浸入冰冷富氧的林格氏溶液，立即在迷你尤斯灌流室将黏膜一侧朝上固定住。平衡30min后，在2h内每15min，获取一次PD（电势差）、Isc(短路电流)和RT（总电阻）的基础电子读数。食管黏膜超微结构变化的镜检：每组处死上3只鼠，切开食管黏膜组织，用二甲胂酸缓冲液固定，之后用醋酸铀酰染色，以聚/床812树脂包裹，超薄切片机切厚薄两种切片，厚切片用甲苯胺蓝硼砂染色后，光镜下为薄切片寻找适合镜检区域，薄切片固定在铜栅格上，用醋酸铀酰和雷诺柠檬酸铅进行双染，透射电子显微镜镜检。用显微生物学组件分析镜检照片上至少30个细胞的细胞间隙和电子致密物质密度。 细胞间隙是测定两个相邻细胞细胞膜之间的区域。细胞间隙中的电子致密物质密度用除以细胞间隙得到的平均灰度值计算。用方差分析比较各组之间的差异。,实验设计,RNA分离：每组处死3只鼠，切开食管黏膜，用RNA组织提取试剂盒提取总RNA，凝胶电泳测质量，分光光度计测浓度，生物分析仪测RNA完整性（RIN）。（RIN是RNA降解程度的指标，RNA的RIN必须在7以上才适合做芯片分析）基因表达谱分析：文中的芯片分析就是基因表达谱分析，目的是分析对照组和模型组食管黏膜组织中各种差异表达的基因和基因簇及其丰度。（基因表达谱是通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库，大规模cDNA测序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成，从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息。一般需要纯化mRNA做表达谱分析，本文没有说明有没有提纯mRNA)使用安捷伦双通道小鼠444微阵列芯片，通过北卡罗莱纳大学的芯片数据库进行数据预处理以进行质量过滤和数据标准化。获取的芯片数据映射的基因标记作为基因表达值。使用Excel进行组间（正常组和模型组）基因芯片显著性分析获取差异表达基因（假阳性平均数小于1）。基因簇分析（基因集合富集度分析）也是用Excel进行的。,实验设计,Western杂交：目的获得紧密连接蛋白4，紧密连接蛋白1，环氧化酶4和Nrf2在黏膜组织中的表达情况。 处死小鼠切开食管黏膜；从食管黏膜、舌组织和肝脏组织中分离总蛋白；BCA蛋白试剂测蛋白浓度；蛋白样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；转移到PVDF聚偏二氟乙烯膜中；用脱脂乳粉封闭后，以兔子的抗紧密连接蛋白-1（Cldn1）的多克隆抗体，兔子的抗紧密连接蛋白-4(Cldn4)的多克隆抗体、小鼠的抗环氧化酶-4(Cox-4)的单克隆抗体或者兔子的抗Nrf2多克隆抗体（都经特定缓冲液稀释过）作为探针在4反应过夜；将膜与辣根过氧化物酶标记的小鼠或者兔子的第二抗体共培养；通过辣根过氧化物酶化学发光底物利用X光显影。为了验证等量上样（黏膜组织），将印记剥离并使用小鼠的抗-肌动蛋白(-Actin)的单克隆抗体进行重新杂交。（-肌动蛋白是在细胞的表达水平通常不会发生改变，被广泛用于Western时上样量是否一致的内参，通过内参证明你要检测的蛋白表达水平的变化）,实验设计,组织化学染色：黏膜组织按常规方法制作石蜡切片，按标准方法经行HE染色，之后用显微生物学组件检测切片获得角质化层厚度。（细胞核紫蓝色，胞浆及胞外基质为红色）免疫组织化学染色：目的是定位差异表达的Nrf2、8-OHdG、Cldn4和Cldn1等蛋白在组织中的表达位置。室温下将脱蜡切片浸泡在包含0.3%过氧化氢的甲醇中15min以抑制内源性过氧化物酶活性，之后进行抗原修复。以兔子的抗-Nrf2多克隆抗体，兔子的抗血红素加氧酶-1(HO1)多克隆抗体，兔子的抗紧密连接蛋白-1(Cldn1)多克隆抗体，小鼠的抗紧密连接蛋白-4(Cldn4)单克隆抗体或者小鼠抗8-羟基脱氧鸟苷单克隆抗体(8-OHdG)做为1抗在4反应过夜。以抗角蛋白5（Keratin5）抗体作为免疫组化的标准对照（阳性对照），之后用PBS冲洗组织切片，并与过氧化氢酶标记的第二抗体在37共培养30分钟。使用抗生蛋白链菌素-过氧化物酶反应试剂盒以二氨基联苯胺作为发色物检测抗体复合物。（染色结果阴性蓝色、阳性细胞质橘红色，阳性细胞核深橘红色）计算并分析10个正常人和胃食管反流病人的样品，及Nrf2缺陷型C57BL小鼠、胃部、十二指肠和混合反流模型小鼠的3个样品的Nrf2阳性细胞占总细胞的百分比与核染色细胞占总阳性细胞的百分比。阳性染色细胞的百分比通过3只野生型小鼠和3只Nrf2缺陷型小鼠测定。进行统计分析以比较野生型和Nrf2缺陷型小鼠的8-羟基脱氧鸟苷的表达水平。,实验设计,ATP含量测定：食管黏膜组织样品称重，并在三氯乙酸中均质。用蒸馏水稀释上清液，用一种生物荧光ATP试剂盒测定ATP。使用微孔板检测仪（即酶标仪）的ATP荧光模式测定3min内的荧光信号，设定积分时间为1.0s，绘制标准曲线。用测得总量除以每个样品的各自的重量得到ATP的浓度。染色质免疫共沉淀:目的是确定推测的Cldn4、Cldn1是不是Nrf2的靶基因。通过锚定组合转录因子结合位点（TFBS）聚类分析预测紧密连接蛋白4的5kb长的5-上游DNA序列中的Nrf2结合位点。在紧密连接蛋白4的上游341bp 347bp 和423bp 429bp片段处找到了“保守结合位点簇组合”（TGAGTCA）。使用EZ-ChIP试剂盒对三个平行样进行染色质免疫沉淀分析。使用对照组小鼠免疫球蛋白G（IgG）或者兔子的抗Nrf2多克隆抗体进行免疫沉淀操作。取2L免疫沉淀的DNA用下面的引物对进行35个循环的PCR扩增：紧密连接蛋白4 (5-GTTGTCCCCACCCGGTGAGCATC-3和5-GGCCAACAAAGGCGTTCAGAGGC-3; 预测大小: 168 bp); 醌氧化还原酶1 （Nqo1） (5-GCAGTTTCTAAGAGCAGAACG-3 和5-GTAGATTAGTCCTCACTCAGCCG-3; 预测大小: 176 bp); P63（一种肿瘤抑制基因） (5-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3和5GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3; 预测大小: 210 bp)。作为一种知名的Nrf2靶基因，醌氧化还原酶1作为阳性对照，P63（不是Nrf2靶基因）作为阴性对照。,结果与讨论,正常人,胃食管反流病人,图1：人体活检样品的组织化学免疫染色,Nrf2在正常人食管活检组织中的表达（A、C、E）；Nrf2在胃食管反流病人活检组织中的表达（B、D、F）；C、E为A的局部放大图，D、F为B的局部放大图。（染色结果阴性蓝色、阳性细胞质橘红色，阳性细胞核深橘红色）在正常人食管中，Nrf2蛋白主要存在于上皮细胞的细胞质中（C），而不是存在于基底细胞中（E）。但在胃食管反流病人的活检样品中（B），Nrf2在上皮细胞（D）和基底细胞（F）中过量表达，并易位到细胞核中。,结果与讨论,正常小鼠食管黏膜中Nrf2蛋白出现在上皮细胞和基底旁细胞的细胞质中，胃反流、十二指肠反流或混合反流4周后，在上皮细胞，基底旁细胞和基底细胞的细胞核中出现了Nrf2蛋白，上调显著；十二指肠反流和混合反流模型中，血红素加氧酶表达上调（Nrf2的一种标记物）。,图2：四周后小鼠模型样品中Nrf2的组织化学免疫染色结果,非手术对照,十二指肠反流,胃反流,混合反流,人类活检样品：胃食管反流样品中Nrf2蛋白表达上调显著，在细胞核中表达上调显著；血红素加氧酶(Nrf2靶基因)表达上调显著,小鼠模型样品：反流模型样品4周后，食管黏膜组织中Nrf2表达上调显著；十二指肠、混合反流模型中血红素加氧酶表达上调,Nrf2在胃食管反流病中被激活,结果与讨论,非手术对照,胃灌流,十二指肠灌流,混合灌流,图3：野生型和Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜跨膜电阻，两表纵坐标为电阻，上表横坐标为时间,跨膜电阻是黏膜屏障功能的指标。Nrf2缺陷组的食管黏膜跨膜电阻在每个时间点显著低于野生型小鼠，表明Nrf2在食管黏膜中发挥了抵抗离子转运的保护作用。反流手术4周后，野生型和Nrf2缺陷型小鼠都出现了食管跨膜电阻的显著降低，尤其是在那些经历胃反流和十二指肠反流的小鼠中。胃反流和混合反流组中，Nrf2缺陷进一步降低了食管的跨膜电阻，但十二指肠反流组却没因Nrf2进一步降低跨膜电阻。这些数据揭示了在是否患胃食管反流病时，Nrf2都在食管抗性方面发挥保护作用。,Nrf2缺陷型,混合反流模型,图4：透射电子显微镜下反流四周后小鼠食管黏膜基底细胞层中的超微结构变化的形态学和量化（放大倍数4,400x; 尺寸栏size bar = 2 m）,非手术对照组,胃反流模型,野生型,结果与讨论,十二指肠反流模型,胃反流Nrf2缺陷组食管基底层中细胞间隙的增宽、线粒体数量的减少、可见细胞桥粒减少、基底细胞之间的电子致密物质减少，表明Nrf2缺陷型小鼠的基底细胞之间的细胞间粘附力降低了；胃反流Nrf2缺陷型小鼠中从基底细胞延伸进入基底膜的细胞过程也减少了，表明Nrf2缺陷型小鼠中，细胞与细胞外基质间的粘附力也降低了；胃、十二指肠、混合反流的野生型小鼠，黏膜基底层细胞间隙增宽；胃、十二指肠、混合反流的Nrf2缺陷小鼠显示，Nrf2缺陷显著加剧了黏膜超微结构变化；定量分析表明Nrf2缺陷鼠的细胞间隙显著增宽，电子致密物质显著减少，在胃反流模型中更加显著。,结果与讨论,食管黏膜组织化学染色（HE染色）结果：野生型和Nrf2缺陷型小鼠的食管黏膜没有组织形态和厚度的明显差异。,结果与讨论,野生型和Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜基因及基因簇表达的差异基因表达谱（芯片分析）结果基因表达差异：相比于野生型小鼠，15种已知的Nrf2靶基因（醛糖还原酶8 Akr1b8, 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基Gclc, 谷胱甘肽S转移酶A3Gsta3, 谷胱苷肽s转移酶m1 Gstm1, Gstm3, 红细胞衍生核因子2样蛋白2 Nfe2l2, 醌氧化还原酶1 Nqo1, 胎球蛋白A Ahsg, Ces1, Esd,Gstp1, Mgst1, Npn3, Pparg and Selenbp2）在Nrf2缺陷型小鼠中的表达被下调了。由于这些基因都是已知的与应激反应和解毒作用相关基因，数据表明Nrf2在野生型小鼠的食管黏膜细胞中正常活化以提供抵抗生理应激的保护作用。（在胃反流模型中，相比于野生型，Nrf2缺陷型小鼠中有7种已知的Nrf2靶基因（Nqo1, Gstm1, Akr1b8, Gstm3,Gclc, Pln, Gstp1）表达被下调了。在十二指肠反流模型中，5中已知的Nrf2靶基因表达被下调了（Nfe2l2, Nqo1, Gstm1, Gstm3,Ptgr1）。在混合反流模型中，有24种已知的Nrf2靶基因的表达被下调了（Gstm1, Gsta3, Gstm3, Nfe2l2, Nqo1, Gstm2, Blvrb, Hmox1, Entpd5, Cbr3, Ppp1r12b,Gclc, Mgst3, Gstm5, Txnrd1, Cat, Meis1, Ftl1, Sdpr, Selenbp2, Pparg, Gstp1, Esd, Mgst1)。）基因簇表达差异：相比于野生型小鼠，Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜中有20个跟刺激/应激有反应和氧化还原酶活性相关的基因簇的表达被下调了；与Nrf2缺陷型小鼠基底细胞中线粒体数量降低相一致，在缺陷信小鼠的食管黏膜中有11个与线粒体合成相关的基因簇和32个与代谢和能量相关的基因簇表达被下调了,结果与讨论,图5：野生型和Nrf2缺陷型小鼠黏膜中8-OHdG的组织化学免疫染色结果（A、B），ATP浓度（C）和线粒体标记蛋白COX-4的Western杂交结果（D）,8羟基脱氧鸟苷是一种DNA氧化损伤的标记物。相比于野生型，8OHdG在Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜细胞的细胞核中表达急剧升高（A，B，A，B）；相比于野生型，缺陷型小鼠食管黏膜中ATP含量显著降低（C）；环氧酶4是一种线粒体标记蛋白，在缺陷型小鼠中，Western杂交测定的Cox IV表达显著下调（D）。这些结果表明Nrf2缺陷型小鼠的食管黏膜出现了线粒体功能障碍。,Nrf