【毕业学位论文】（Word原稿）拟南芥T-DNA插入突变体的蛋白质谱分析植物病理学博士论文

密级 : 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 拟南芥 入 突变体 的 蛋白质谱分析 h. D. i 摘 要 转基因植物中非预期效应的产生有着复杂 的 遗传和环境因素，现有的检测方法主要依靠对 已知的营养因子、抗营养因子和毒素等成分进行广泛的化学分析， 但这些方法还存在着严重的不足，特别是在 可能出现未知的毒素或抗营养因子，以及缺少有效的检测方法的情况下，这种方法具有很多局限性。 为了研究非预期效应产生的机理和 增加检测出非预期效应的可能性，需要采用各种不同的 、 更加有效的 策略 。为此，本文以蛋白质组学方法来研究 拟南芥 入突变体中蛋白 质表达谱的变化，为蛋白质组学方法在非预期效应研究中的应用奠定基础 。 以模式植物拟南芥为材料，对采用 入方法获得的拟南芥突变体进行 增出 侧翼序列 并测序 ，经过与拟南芥基因组数据库进行比对，确定 插入位点。 选择 入位点分别位于基因间、内含子区、外显子区、基因上游和基因下游 5 种不同 入位点类型的 12 个 拟南芥突变体，在开花结束、衰老之前提取全蛋白进行差异蛋白质组学分析。 对拟南芥突变体的差异蛋白质组学分析基于双向电泳，为获得其蛋白质组表达谱的全貌 ，采用了 17cm 制干胶条进行第一向等电聚焦，随后进行 考马斯亮兰 色的双向电泳凝胶可以稳定地检测到 400蛋白质点。 在双向电泳专业分析软件 辅助下，对拟南芥突变体的蛋白质组表达谱进行分析。分析结果显示，在拟南芥个体的蛋白质表达谱之间存在着较大的个体差异，说明在确定转基因植物自然变异的基线标准方面还需要做很 多 工作，这是进行各种分析的基础。在 12 个突变体中，共有 102 个表达量发生显著变化的蛋白质点经胰蛋白酶 胶内酶解后进行 析，其中， 59 个点表达量上调， 43 个点表达量下调。共有 66 个蛋白质点通过数据库检索得到了鉴定，它们分别属于 初级代谢， 能量传递， 细胞生长、分裂， 转录调控，蛋白质合成与降解， 贮藏蛋白， 结构蛋白， 信号传递， 植物防御， 次生代谢， 功能未确定， 说明外源基因的插入和表达对植物的生命活动有着广泛的影响。 但没有发现新蛋白，未发现植物生理、生化和代谢过程中发挥重要功能的蛋白质或致 敏和毒素蛋白质。 部分蛋白质点在拟南芥突变体中以较高的频率出现，如 1 号蛋白质点，在分属 5 种 种突变体中出现，可能预示着转基因植物中某种共有的变化机制及其在非预期效应检测中作为标志性分子的可能性。 蛋白质组学技术是转基因植物中非预期效应的很有前景的一种研究方法，但在技术平台的优化、 保证 特异性、灵敏度和 其结果 有效性 方面还需要进一步加强研究 。此外，蛋白质组学方法的成功应用需要建立相应的数据库，其中应包含对应于 转基因植物 不同开发阶段和环境条件下的 自然 变异信息 。 关键词 ：转基因，拟南芥 ， 生物 安全 ， 非预期效应 ， 蛋白质组学 of of 003 7700000 no to of of is of or as a of of on of s). of in of as a of is of of be by an of of an of of of in in no of to in as a of of M NA we of to of be of In to to of in by a of to A 2 in in of a of a in 3 of of 70 of of in We a pH in an of to in to on a 2002of 7.2 of in of to of Its On of (i) in in (in in A 02 by 66 by to no of or o.1 of be as At of is of is of of to M to be on in in 录 摘 要 . i . 一章 引 言 . 1 1 现代农业生物技术的发展及生物安全 . 1 2 转基因植物 可能产生 的非预期效应 . 3 3 植物蛋白质学研究进展及其在生物安全研究中的应用 . 9 4 本研究的立题依据和研究意义 . 15 第二章 拟南芥的遗传转化 . 16 1 材料与方法 . 16 生型拟南芥的种植 . 16 化载体 . 17 器浸蘸法转化 . 17 南芥 基因组 提取 ( ) . 18 南芥突变株的 定 . 18 2 结果 . 19 南芥突变体基因组 提 取 . 19 南芥突变体的 定结果 . 19 第三章 入位点侧翼序列的测定 . 20 1 材料与方法 . 20 剂和仪器 . 20 南芥突变株的 . 20 条带的扩增及回收 . 22 入位点的确定 . 23 2 结果 . 23 南芥突变体 定结果 . 23 试验中选择的突变体的 翼序列测定结果 . 23 试验选择的突变体的 入位点 . 26 第四章 拟南芥突变体的蛋白质组学分析 . 27 1 材料与方法 . 27 料 . 27 育植株 . 27 织蛋白的提取 . 27 白含量测定 . 28 电聚焦电泳 . 28 条的平衡 . 28 . 28 胶扫描和图像分析 . 29 内蛋白质酶解 . 29 S . 29 白质数据库检索 . 29 2 结果 . 30 白质含量测定 . 30 南芥蛋白质双向电泳 . 30 v 南芥突变体蛋白质双向电泳图谱的软件分析 . 31 南芥突变体差异表达蛋白质 定 . 32 南芥突变体蛋白质组双向电泳及差异蛋白鉴定结果 . 34 3 讨论 . 48 法对拟南芥蛋白质组的分离 . 48 S 鉴定蛋白质 . 48 达差异蛋白质的区分标准 . 48 鉴定的蛋白质的功能分类 . 49 些蛋白质 出现在多个插入位点类的突变体中 . 49 白质组学研究可为非预期效应研究提供有益线索 . 50 白质组学在转基因植物非预期效应研究中的应用需要标准化 . 50 第五章 结论 . 51 参考文献 . 52 致 谢 . 63中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 1 现代农业生物技术的发展及生物安全 近三十年来，生物技术的发展在农业领域取得了重大的成果， 并逐渐发展成为强大的现代生物技术产业， 给人类社会和经济的发展带来了深远的影响。生物技术的应用可以减少生产成本，提高作物产量，降低病虫害 防治 的农药使用量，减少对环境的破坏，开发更富营养、更安全的新食品，是满足日益增长的人口对更高品质的食品需求的重要方法之一。 据不完全统计，目前至少已在 100多 种植物中成功获得了转基因植物，包括水稻、玉米、 马铃薯等粮食作物，棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物，以及番茄、黄瓜、荠菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜、苜蓿、白三叶草、苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓、矮牵牛、菊花、香石竹和杨树等；所涉及到的性状从最初的抗虫、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗除草剂、抗旱、抗盐渍等，到现在的品质改良、生长发育的调控和提高产量等。 迄今为止，世界各国已试种的转基因植物超过 4500种，已批准商业化种植 的 近 90种。 自 1996年转基因植物开始商品化以来， 经过 7年的持续增长， 2003年全球转基因植物的种植面积已达 6770万 公顷 (2003)，全球市场价值 45 6年来，全世界共有 几 亿人在食用转基因食品，美国市场上已有近 4000种食品来自基因工程生物。经过 5年严格的论证，对转基因植物持相对保守态度的英国最早将于 2005年春季开始商品化种植转基因玉米 (2003)。 但另一方面， 随着基因工程 产品 日渐商品化 ， 有关重组 术潜在危险性的争论发自欧盟继而波及全世界。生物安全是指现代生物技术的开发和应用可能产生的负面影响， 及 所采取的有效预防和控制措施，目的是保护生物多样性、生态环境和 人体健康。 其研究的主要内容包括转基因生物的环境安全和食品安全。 转基因产品可能对人体健康产生的潜在影响主要有以下 几 个方面 ， 外源基因是否会通过异源重组进入人的遗传体系中 。目前 普遍 认为这种可能 只 是在理论上具有极小的概率 (2004; 2004)。 由 于重组和水平基因转移 产生具有“超级抗性”的病原微生物会危害人类健康。 这 种 情况 在使用抗生素标记基因时有很小的可能 性 (2004)， 但 随着标 记删除技术及更安全的标记基因的使用，这 个问题可以被彻底解决 (2004; 2004; 2004)。 转基因食品是否具有毒性 、 能否引起人体的过敏 反应 、营养价值是否与传统对应食品有差异 及转基因食品中出现非预期效应的可能性 (2003)。关于毒性问题只有一些相关的动物试验报道，尚无关于人体的研究报告 (2004)。转基因食品引起人体过敏性反应的发生概率相对可能高一些， 在 大豆中表达巴西坚果 ( 2S 白蛋白 (et 1996)和美国 米 事件 (2000)均与过敏原有关， 但 在造成明显的危害之前即被终止。目前 过敏源检测和安全管理更加完 善 和严格，如仅就技术上讲是安全的 (2002; 2001; 2002)。 化学分析和动物试验证明在营养成分上，转基因植物与常规品种没有差异（ 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 2 2002; 2001）。 对于非预期效应则争论较大，且在研究手段上有一定的难 度 。 转基因 技术 的商品化 目前主要 是 在 转基因植 物上 ，主要问题有： 出现具有多种抗性基因的超级杂草，这类问题发生的可能性相对大一些，并已经有了一些相关报道 (2003; 1999)。 出现具有高度抗药性的农业害虫 ，这 是一个关系到经济、生态和公众健康的 重 大问题，关于此类问题的报道具有一定的实验依据， 例如，试验室研究表明， 棉铃虫 对 生 抗性的时间是 12 代 （ 2004） ，但田间尚未产生明显的抗性。 而且 需要说明的是：具有 抗性的害虫出现不仅仅是由于抗虫转基因作物的种植，农药的使用也同样会使害虫的抗药性增强。 病毒重组或异源包装会产生新的农作物病原物。此类现象在自然界可以发生，在实验室中也曾获得验证，但在田间试验中尚无报道。 有些风险如异源包装很容易通过改进转化策略而消除，但有些问题还需要 进行深入研究和长期跟踪调查 (2002; 2000)。 基因漂流导致的转基因向非转基因植物和野生亲缘种中扩散。 在栽培作物和其野生近缘种具有 共同分布的区域，转基因逃逸到野生种群的可能性 较 大 （ 2003; 2004; 2003） ， 转基因在自然界的命运取决于转基因作物与近缘种间杂交后代的适合度， 且 适合度可能有一个动态的过程 （ 2002; 2002）。 对于转基因在环境中保留和不断扩散将会导致怎样的生态后果，目前所掌握的资料和知识均非常有限。 由 于花粉漂移造成的转基因扩散，受到 作物种类、 释放面积和环境条件的影响 （ 2002; 2004） ，在进行距离 隔离时应加以考虑。目前，不断有新的生物技术手段被采用来降低或杜绝花粉漂移造成的转基因扩散(2002; 2001; 2003)。 水平基因转移导致转基因向植物病原微生物扩散。这种现象只在 带有与 植物 基因同源序列的 土壤微生物 中 发现 且其频率极低 (2001; 2002; 2003)。 转基因 植 物的 大面积释放 也 有可能 会对 生物多样性 产生不利影响 ： 转基 因植物具有野生植物没有的各种抗性， 可能 会迅速成为新的优势种群，从而影响生态平衡。 不 少作物已被人类驯化到 没有 人类的耕作就生存不了的程度， 个别性状的遗传改良并不会增加其侵袭性 等 (2001)。 但 由于转基因作物的大面积释放时间尚短，对它的长期效应还需要进行系统的研究（ 2004）。 对非目标生物的危害将不利于生物多样性。 但 到目前为止， 在实验室内观察到的对非目标生物的影响在田间极少发生（ 2002）。 不同基因对不同生物的影响是不 同的， 对该问题更长期和更具体地进行研究将是十分必要的 （ 2002; 2001; 2003; 2002; 2003） 。 随着越来越多的转基因产品进入市场，转基因植物中可能出现的非预期效应也逐渐引起人们的关注。在相关文献中， 虽然 非预期效应较多的与转基因食品安全性联系在一起，但它的研究意义不仅仅在于此，外源基因的插入会对植物的生命活动会产生深刻的影响，各种效应的产生是基因之间相互作用、代谢网络综合调控的结果，因此，非预期效应产生机制的揭 示会对基因功能、基因间相互作用、网络调控等诸方面提供参考，对转基因植物安全性评价具有重要的理论和实践意义。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 3 2 转基因植物 可能产生的 非预期效应 目前， 在实验室条件下可以非常精确地对 施剪接，但现 有 的技术仍然无法 精确 控制和预测遗传信息插入植物基因组的位置和拷贝数，况且植物体是一个复杂的生物系统，无数的细胞、代谢途径和生物分子都是相互影响、相互作用的，当一个 子导入植物体后，它对整个植物的影响是无法完全预测和控制的，除了产生预期的结果外，还可能产生其他 非 预 期 的变化，甚至是有害的结果，这就是非预期效应 。如引发基因突变或改变代谢途径，致使其最终产物可能含有新的成分或改变现有成分的含量等，也有可能以不可预测的方式改变受体植物的细胞代谢，从而使食品中产生新的毒素或过敏源，这些改变也可能抑制植物体内一些重要营养物质产生，使食品中缺乏这些重要的营养物质。 对于转基因植物的非预期效应进行安全评价，主要基于以下几个方面的理由： 转基因植物中的的外源基因来源不同于常规育种。常规育种由于受有性亲和性的限制，其基因均来自于同一物种内；而建立在重组 术基础上的植物基因工程技术，可以克服常规育种技术的不足，打破物种间 的天然屏障，实现基因在动物、植物、微生物之间的转移，甚至可以将人工合成的基因导入生物体内。因此，转基因植物的基因既可来于种内，更多的来自于不同的物种间。由于遗传背景不同，目前还不可能完全精确地预测一个外源基因在新的遗传背景中会产生什么样的相互作用，且转基因植物中基因的表达受环境等多种因素影响 (1999)，在转基因植物中有可能出现一些在常规育种中不曾遇到的新组合、新性状，它们是否会影响生态环境和人类健康，目前还缺乏知识和经验。 基因多效性 (一个基因可能 具有多种不同的性质和功能从而对植物发育的多个方面产生影响，在试图改良一个性状时，由于外源基因的插人而对宿主体内某些基因的表达产生影响，导致其他性状也随之发生了变化 (1998)。基因的多效性有的可预测，有的不可预测，其效应可有利或不利。 转基因作物中外源转基因的插入位点和插入的拷贝数存在很大的差异。一般情况下，在农杆菌介导的转化 (株中，外源转基因的拷贝数多为 1 个，但有时也会出现多个，在一些双子叶植物中 拷贝数 平均为 3 个，偶尔高达 20 50 个。 位点效应 ( 染色体上的插入位点是随机的，它可以插入到任何一条染色体。由于基因插入的位置不同，因周围基因的影响， 可能 使外源转基因在转化植株中的表型和遗传学特性有所不同。根据现有的知识，基因的插入的位置确实会影响基因表达的强度和稳定性 (2001)。 插入突变 (由于基因整合的随机性，外源基因可以插入宿主基因组的非编码区、结构基因区或 调控区，引起插入突变。最常见的 情况有 2 种，一是由于外源基因的插入引起宿主体内某一基因的失活。一般来说，这种情况比较常见，因为通常基因在转录活跃区的整合机率大于静止区。如果插入发生在植物基因组中一个或多个重要酶基因之中，这些基因可能不再表达重要的蛋白酶，这些酶所催化的代谢就会被阻断，从而使植物体内可能聚合某些毒性复合物或者不能产生重要的营养物质；如果插入发生在某个重要基因附近，可能会改变这个重中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 4 要基因的表达，而这种表达水平的改变可能会使这个基因产物成为毒素或过敏源，也可能使细胞代谢发生改变，导致毒素或过敏源的产 生或重要营养物质的缺乏；如果插入发生在功能未知的列之中，由于这段 序列功能还不清楚，它的突变带来的危害也无法预料，但不能完全否定这种危害的存在。 另一种情况是由于外源基因的插入使阻抑基因失活，则可以使原来沉默的基因激活。虽然目前的科技水平还难以预测一个外源基因在新的遗传背景下会发生什么样的相互作用，但目前尚无随机插入激活毒性代谢途径的报道。 转入植物中的许多转基因的产物是高水平表达的酶，来催化各种生物化学反应，这可能会导致一系列的次级效应 (1999)。通过表达转基因来提高酶的生物合成，会发生耗尽酶底物和酶反应产物积累的情况。而在代谢途径中改变代谢物流动导致非预期的增加或降低其他物质含量的情况也有相关报道。在植物细胞中表达的新酶活性也可以导致某种代谢物从一个次生代谢途径转换到另一个途径。 目前，对这些情况还所知甚少，估计在不同作物之间，同一种作物的不同品种、品系都会存在差异。这种转基因表达所带来的次