【毕业学位论文】（Word原稿）抗菌肽LfcinB15-W4,10多拷贝表达载体的构建及融合表达微生物制剂与应用技术硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 抗菌肽 0 多拷贝表达载体的 构建及融合表达 of 0 F of 0 I 摘 要 随着传统抗生素的广泛使用，关于药物残留和菌株耐药性等问题的争论日益激烈。研究与开发更为有效，同时对人、动物及环境安全 无害 的传统抗生素替代品是当今科研领域的研究热点之一。抗菌肽由于具有有效的抗菌活性及 独特 的抗菌机制，在替代传统抗生素方面显示了巨大潜力。牛乳铁蛋白肽（ 其衍生肽具有高效广谱抗菌等多种生物学功能。其衍生肽 0 是由 15 个氨基酸残基组成的阳离子型抗菌肽 ， 由于氨基酸序列的优化，其功能活性较 所提高，且本身不含稀有氨基酸和外源化学成分，所以是一种极具应用潜力的健康安全的抗菌替代物。本研究 比较了 0 和 常用抗生素的体外抑菌活性， 通过基因工程技术表达 0，为 大 规模生产 0 奠定 了 理论与实践基础。本研究主要结论如下： 在 体外抑菌实验中，化学合成 0 的总体抑菌效果比青霉素、金霉素、链霉素、多西环素稍差，但是仍然对测试菌株表现出较强的抑菌 活性 。根据 0 氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性设计合成编码基因 ， 设计非对称粘性末端 5 接酶作用下首尾串联成多聚体编码序列。分别设计含有 和 酶切位点的接头，将多聚体编码基因定向插入表达载体 建重组表达载体 0)n。经菌落 序验证后得到含有单拷贝至七拷贝和九拷贝编码基因的转化子。 导 表达 ，蛋白质电泳分析结果表明不同拷贝数的多聚体融合蛋白得到特异性诱导表达，其中四聚体融合蛋白表达水平最高，占菌体 总 蛋白的 45%。经 亲和层析柱纯化回收四聚体融合蛋白，纯度达到 上，每 1 升细菌培养物可得到约 73 合蛋白。按照每毫克四聚体融合蛋白加入 5 单位凝血酶进行裂解，在 25 保温 48h 可实现完全裂解，经电洗脱回收得到纯度在 99以上的 0 四聚体。利用薄层琼脂扩散法检测重组 0 四聚体抑菌活性，对金黄色葡萄球菌 5923 具有明显的抑制作用。经微量肉汤稀释法测定其 对金黄色葡萄球菌 最小抑菌浓度 （ 为 16 g/ 本实验成功实现了抗菌肽 牛 乳铁蛋白 肽 衍生肽 0 在大肠杆菌 的串联融合表达，平均每升细菌培养物最终可以获得 10 度 99以上的具有抑菌活性的重组0 四聚体，为基因工程方法生产 0 及其它抗菌肽奠定了理论与实践基础。 关键词 ： 抗菌肽，牛乳铁蛋白肽，多聚 体 化 ， 融合表达， 大肠杆菌 on of of to is of be in as of to of as as 0 is a 5 0 of of t so it is of In 0 0 by is in In of in 0 0 in 0 on to . 4 0 of 0)n. to by CR NA In 0 5% of 73 mg 0)4 . by at a U/mg 5 8 9% . 5923. IC . 5923 6 g/mL by 0 10 mg of 9% a 0 to 录 第一章 引言 . 1 究目的与意义 . 1 菌肽研究进展 . 1 介 . 1 菌肽的来源及分类 . 1 菌肽生物学功能及其机理 . 5 菌肽基因工程 . 7 菌肽研究前景 . 8 铁蛋白肽研究进展 . 9 铁蛋白（ 介 . 9 铁蛋白肽及其衍生肽研究进展 . 10 第二章 0 抑菌活性测定 . 19 验材料 . 19 验方法 . 19 验结 果 . 20 论与讨论 . 21 第三章 0 串联多聚体表达载体构建及其融合表达 . 22 验材料 . 22 粒与菌株 . 22 饰酶类与其他生化试剂 . 22 物合成及 序 . 22 养基及缓冲液等配制 . 23 要仪器设备 . 24 验方法 . 24 0 编码基因串联 . 24 组表达载体构建及其鉴定 . 27 组融合蛋白表达及诱导条件优化 . 30 的融合蛋白表达纯化 . 31 血酶裂解融合蛋白及 0 多聚体纯化 . 32 组 0 多聚体抑菌实验及 定 . 32 验结果 . 33 0 编码基因串连连接 . 33 组表达载体构建及转化子鉴定 . 33 合蛋白的诱导表达 . 33 导条件优化 . 35 目的融合蛋 白的纯化 . 37 血酶酶切及四聚体电洗脱回收 . 38 0 四聚体抑菌实验及 定 . 38 论与结论 . 40 乳铁蛋白肽衍生肽 0 . 40 因工程表达 0 . 40 论 . 43 参考文献 . 45 致 谢 . 53 作者简历 . 54 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 究目的与意义 在日常生产和医药卫生领域滥用抗生素，引起的大量耐药性菌株的产生和药物残留等问题 的争论日益激烈，其解决方案越来越受到科学家以及高层决策者的普遍关注。研究与开发更为有效，同时对人体和动物及环境有安全保障的抗生素替代品成为当今科研领域的研究热点之一。抗菌肽（ 乳铁蛋白肽（ 其衍生肽具有高效的广谱抗菌活性等多种生物学功能，且本身不含稀有氨 基酸和外源化学成分，所以是一种极具应用潜力的健康安全的抗菌替代物。其 15 肽衍生肽 0 由于其氨基酸序列的优化，其功能活性较 较大提高。由于 0 不同于传统抗生素的抗菌机制，而在实际应用中不易产生耐药性菌株，因而在替代传统抗生素方面显示了巨大的潜力和广阔的应用前景。用传统化学合成法生产 0，其生产工艺复杂，对设备要求高，成本昂贵。本课题的研究目的即利用基因工程技术构建 0 重组表达载体，以期构建基因工程菌株， 高效表达 0，并对重组 0 的抑菌活性进行鉴定。解决 0 来源问题、降低其生产成本，为下一步规模生产抗菌肽 0 创造条件，奠定理论与实践基础。构建重组表达载体，在大肠杆菌中利用基因工程技术表达 0，还为研究和生产其它种类活性肽，提供重要依据，对活性肽类规模化生产和应用具有重要意义。 菌肽研究进展 介 青霉素的发现与广泛应用使人们在应对病原微生物感染而引发的各类疾病时不再束手无 策，并由此研制了大量的 保护人类健康做出了巨大贡献。但随着传统抗生素的广泛使用，不断产生出诸多新的问题。其负面作用主要有： 品或饲料工业中抗生素的添加，导致产品中抗生素药物的残留，直接威胁人类健康，破坏生态环境；破坏生物机体内正常的微生态平衡；对人和动物的机体免疫力产生不良影响（熊家林等， 2001；郭兴华等， 2002）。于是人们开始寻找新型的抗菌制剂，研究发现，某些阳离子型生物多肽具有广谱的抗菌活性，同时在抗菌机制等方面具有许 多传统抗生素无法比拟的优越性，且目前为止还未发现会诱导抗药菌株的产生，很有希望成为新一代抗菌制剂（ 1997）。 菌肽的来源及分类 生物在进化过程中，机体必须具备防御有害病原体入侵的防御机制才能得以生存繁衍，因而中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 在长期进化过程中形成了巧妙而又复杂的免疫系统。普遍认为高等生物有机体在受到病原体入侵时，首先起作用的是先天性免疫机制，其次才是 T 细胞与 B 细胞等免疫细胞的获得性免疫机能发挥作用，二者共同抵挡病原体的侵染。研究发现，在自然界中，昆虫、哺乳动物和两栖动物等许多种类的生物有机体的先 天免疫系统能够产生各种种类的活性物质用来抵御病原微生物的侵害（ ， 1998）。先天性免疫是保护有机体免受外来病原体侵害的第一道屏障。而对于低等动物，它们在没有淋巴细胞和抗体的情况下，依赖于体内一种不同于传统抗菌物质的活性肽来抵抗微生物的入侵，抗菌肽的存在对于它们抵抗病原微生物侵害显得尤为重要（ 001），在免疫防御系统中扮演着极为重要的角色。在机体受到病原体侵害时，抗菌肽以活性形式由细胞或组织内合成或释放出来，发挥抗菌及其它生物学功能（ 2003）。 抗菌肽能够有效杀死细菌或抑制细菌生长，其生成和释放是宿主免疫防御系统的重要组成部分（ 2003），天然的抗菌肽通常是由十几个至几十个氨基酸残基组成的小分子多肽，一般小于 10 有多个带正电荷的氨基酸，如赖氨酸（ 精氨酸（ 多数抗菌肽的等电点大于 7，表现出较强的阳离子性， N 端亲水， C 端疏水具有双亲性，水溶性好，具有较好的热稳定性，对较高的离子强度和 均具有较强的抗性。此外部分抗菌肽具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力，例如 。抗菌肽由基因编码、核糖体合成（ ， 2004），或由大分子功能蛋白降解形成。 人首次通过对滞育的天蚕 注入活的 为诱导，从蚕蛹的血淋巴中首次分离出两种低分子量的，具有极强抗菌活性的肽类物质（ ，1980）。后来，霍夫曼等人证实了这些肽的存在。他们用事先浸泡在细菌培养液中的针头对昆虫进行注射，发现细菌对昆虫没有产生任何影响，而在 12 至 24h 以后，昆虫产生了大量的肽类抗菌物。 人在 公布了它们的一级结构并给这类肽正式命名为 1981）。所以抗菌肽原先的概念是某些昆虫经外部刺激诱导产生的具有抗菌作用 的 肽类物质。 （ 1989）从猪的小肠中分离到与抗菌肽同源性极高的短肽序列，使人们对抗菌肽的起源 及其 在生物进化中的地位产生了新的见解。随后又在其他生物体内陆续发现了多种抗菌肽，随着研究的深入和进一步展开， 一些抗菌肽的氨基酸序列和基因序列陆续得到确定。 如蛙皮素（ 蜂毒素（ 防御素（ （石强与刘飞鹏， 2000）。抗菌肽分布广泛，由于近年来人们对抗菌肽的愈加关注及多肽分离鉴定及合成技术的不断进步，如今抗菌肽的发现速度越来越快，发现的种类越来越多。图 1出了截止到 2001 年来已发现的抗菌肽数量。到 2004 年 11 月 1 日为止（ 已有 880 种抗菌肽从各种不同的生物组织中分离 得到 ，其来源包括昆虫、植物、两栖类动物、哺乳动物、鱼类、蟹类、线虫类、蠕虫类等各类生物。 抗菌肽在自然界中分布广泛，来源不一， 虽然在序列和结构上各不相同，但还是有很多共同的特征，例如分子量比较小，并且带有较强的正电荷和具有双亲性的结构等。按照抗菌肽的结构特征，可以分为以下几类（ 2002）：（ 1）阳离子型抗菌肽，是抗菌肽种类最多的一类，到目前为止，已经从不同物种中发现 400多种阳离子型抗菌肽，其中一半以上在昆虫体内分离得到。阳离子型抗菌肽按照结构不同又可分为以下三类：单链无半胱氨酸残基的 螺旋或由无规卷曲连接的两段的 螺旋组成的肽， 括一个或几个 二硫键的富含半胱氨酸的抗菌肽；富含某种氨基酸如 1中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 3 图 1980 至 2001 年已发现的抗菌肽数量 1of 980 001 图 1980 至 2001 年每年新发现的抗菌肽数量 1of 980 001 一些阳离子型抗菌肽及其特性。（ 2）阴离子型抗菌肽，是在哺乳动物上皮细胞中发现的一类新型抗菌肽。（ 3）芳香族二肽。（ 4）来源于氧结合蛋白的多肽。（ 5）由已知功能的较大的多肽或蛋白质解离而来的具有抗菌活力的肽。表 1 近几年国内外科学家比较感兴趣和研究较为成熟的抗菌肽有天蚕素（ 蛙皮素（ 峰毒素（ 铁蛋白肽（ 。其中乳铁蛋白肽（ 称 来源是天然产物乳汁，本身不含稀有氨基酸和外源化学成分，所以 为一种更为健康安全的产品从众多的抗菌肽中脱颖而出，越来越受到各国科学家们的亲睐 。抗菌肽对大多数革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、真菌、病毒、寄生虫都具有不同程度的抑制作用。现在大多数研究者均认为抗菌肽是自然界普遍存在的抵御病原微生物感染的一道防线，它可在生物体的各个器官组织的免疫防御系统中抵御外源病原物的入侵。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 4 表 1离子型抗菌肽（ 2002） 2002) 结构及代表性抗菌肽 来源 抗微生物活性 阳离子型抗菌肽 虫，猪 细菌，真菌，病毒，原虫 囊组织 细菌 栖类动物 细菌，原虫 栖类动物 细菌，真菌 富含某种氨基酸的抗菌肽 富含 蝇 细菌 翅目昆虫 细菌，真菌 富含 翅目昆虫 细菌 富含 细菌，真菌 富含 细菌 含有一个二硫键的抗菌肽 双翅目昆虫 细菌，真菌 蛙 细菌 含有两个二硫键的抗菌肽 I 鲎 细菌，真菌，病 毒 子 细菌，真菌 猪 细菌，真菌，病毒 含有三个二硫键的抗菌肽 乳动物 细菌，真菌 乳动物 细菌，真菌 虫 细菌，真菌，原虫 细菌，真菌 含有多于三个二硫键的抗菌肽 细菌，真菌 蝇 真菌 子 细菌，真菌，原虫 翅目昆虫 细菌，真菌 物 真菌 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 5 表 1阳离子型抗菌肽（ 2002） 2002) 结构及代表性抗菌肽 来源 抗微生物活性 阴离子型抗菌肽 神经肽衍生物 ，人 细菌 牛，人，水蛭，蚌类 细菌 含有 羊 细菌 细菌 芳香族二肽 氨酰 3， 4鲎 细菌，真菌 来源于氧结合蛋白的多肽 血蓝蛋白衍生物 虾 细菌 血红蛋白衍生物 扁虱 细菌 乳铁蛋白 人 细菌，病毒 菌肽生物学功能及其机理 抗菌肽作为一种分子量低、水溶性好、热稳定性好、抗菌谱广、安全可靠的抗菌物质日益受到人们的关注。抗菌肽是宿主免疫防御系统产生的一类对抗外界病原体感染的肽类活性物质，是一种非特异性的免疫应答产物，所以微生物和其他一些理化因素都可以诱导机体产生抗菌肽。抗菌肽的生成和释放是 宿主免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽对细菌、部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有不同程度的杀伤作用。抗菌肽抗菌活性强， 并且其抗菌谱中包括好多具有传统抗生素抗性的菌株。关于抗菌肽的抗菌机制，一般认为抗菌肽 通过改变细胞膜的通透性而发挥抗菌作用，这不同于传统抗生素通过阻断生物大分子合成和破坏细胞壁以达到杀菌目的作用机理。抗菌肽比传统抗生素杀菌速度快，极难产生耐药性菌株。另外，由于一般细菌和肿瘤细胞的细胞膜中磷脂（ 子和脂多糖（ 含量较 高，细胞膜多是带负电荷的，而普通细胞的细胞膜是近中性的，所以阳离子 型 的抗菌肽更易与细菌和肿瘤细胞的细胞膜相结合，选择性的抑制细菌和肿瘤细胞的生长。因此，抗菌肽显示出在医学和农业等各个领域上潜在的研究和应用价值。 菌肽的抗细菌作用及其机理 抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有杀伤作用。国内外已报道至少有百种以上的细菌均能被抗菌肽杀死或抑制。 抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔形成离子孔道，造成细菌细胞膜结构破坏，引起胞内可溶物渗出，而最终导致细菌死亡。抗菌肽分子首先结合在质膜上，接着其分子中的疏水 和两亲性结构也插入到质膜中，通过膜内分子间的相互位移，抗菌肽分子聚集形成离子中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 6 性通道，使细菌失去了膜内外电势差而死亡（饶贤才与胡福泉， 2001； ， 1993； ， 1993； ， 1996； ， 1994）。但是， （ 1994）认为，抗菌肽只是结合到了单位膜的表面上，并未插入膜中，更未形成通道。然而，抗菌肽的作用部位是细菌细胞膜，以及抗菌肽的作用结果是导致细菌细胞质膜通透性增大等基本内容是确切无疑的，这也正是抗菌肽与传统抗生素抗菌机制不同的 本质所在。 关于离子通道形成的具体过程，不同研究者提出了以下几种不同模式：第一种为跨膜螺旋束模型（ 又称为桶状模型（ 螺旋束模型（ 该模型较适合于疏水性多肽与细胞膜的作用模式（ ， 1999） ；第二种为蛀洞模型（ 这种模型与第一种相似，但阳离子型抗菌肽如果按照第一种作用模型形成离子型通道时，会导致电荷密度过高，因此，为降低其电荷 密度，脂质与抗菌肽结合形成离子通道（ ， 1996）；第三种为地毯式模型（ 对于仅由 11于其肽链过短而无法贯穿细胞质膜双层结构（ 992），因此这类抗菌肽首先依靠两亲性结构与质膜结合，当浓度达到裂解细胞膜的阈值时，离子通道形成，造成细胞裂解；第四种为变性剂样效应（ 多肽分子与脂膜结合的过程中，多肽插入脂膜的磷脂头部之间，由于磷脂酰乙醇胺的头部结构占据了一定的结 合空间，因此脂质结构呈倒锥形，以此来缓解结合在双层脂膜的抗菌肽对细胞膜的作用（ 1998）；第五种为平面扩散模型（ 抗菌肽插入脂膜后导致脂膜产生曲张，形成由质脂介导的跨膜通道（ ， 1997）。 一般情况下，细菌胞内渗透压为高渗的，革兰氏阳性菌的胞内渗透压高达 20大气压，革兰氏阴性菌亦达 5大气压。在膜上形成跨膜离子通道后，胞内离子大量流失，细胞不能保持其正常渗透压而死亡。 根据不同的科学家研究结果显示，抗菌机 制可能还存在以下几种模型： a）抑制细胞呼吸：（ 1996）研究发现， 时，就对大肠杆菌表现出强烈的杀菌作用。但当其浓度提高到 70 时，仍然检测不到细胞内 K+的泄漏，这表明 能不是通过改变细胞通透性来杀菌的。当利用 40 理细菌时， 1h 后，可检测到细胞的呼吸作用变弱， 6h 后呼吸作用完全停止。由此认为， 通过抑制细胞的呼吸作用来杀菌。 b）抑制细胞外膜蛋白的合成： （ 1991 年）研究发现 够干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白 和 因的转录，使这些蛋白质含量减少，从而导致细胞膜的通透性增加，细菌的生长受到抑制。 c）抑制细胞壁的形成： （ 1988）等研究认为，能够抑制细菌细胞壁的形成，使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻，但对已经形成的细胞壁无作用。 菌肽的抗真菌作用 研究表明，在感染病菌（注射细菌或真菌或体壁损伤等）的情况下，昆虫能快速合成大量抗菌肽，迅速杀灭已侵入的病菌，并阻止病 菌的进一步侵染。到目前为止，在昆虫中已发现了大量的抗细菌肽，抗真菌肽及既抗真菌又抗细菌的抗菌肽。 （ 1993） 从麻蝇中分离出一种抗真菌肽 首次报道了昆虫抗真菌肽。 67 个氨基酸残基组成，分子中富含甘氨酸和组氨酸。其在蒸馏水和盐溶液中有较强的杀菌能力。有趣的是，从同一蝇中分中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 7 离出的抗细菌肽 A 对 真菌有增效作用。随后有从鞘翅目昆虫东北大黑鳃金龟（ 虫中分离得到 。 由 84 个氨基酸残基组成，与麻蝇抗真菌肽 似，分子内也富含甘氨酸和组氨酸，且分子量相近，但两者在氨基酸序列上却没有明显的同源性（ ， 1998）。果蝇幼虫和成虫经细菌诱导，均可产生广谱抗真菌肽 44 个氨基酸残基组成，分子内含 8 个半胱氨酸残基，形成 4 个二硫键（ ， 2004）。 菌肽的抗病毒作用 1993）报道烟芽夜蛾幼虫的血淋巴对 6 种 毒有明显的抑制作用，使 病毒感染力迅速降低，而且这种抗病毒活性具有广谱性。 （ 1999）试验表明来源于爪蟾的抗菌肽 其它 抗菌肽具有抗疱疹病毒 作用，还发现人的嗜中性粒细胞防御素（ 一种疱疹病毒有抑制作用。此外， （ 1998）研究报道，蜂毒素和天蚕素也可以在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒 基因表达，从而抑制减少 菌肽的抗寄生虫作用 抗菌肽可以有效地杀灭产生人类及动物的寄生虫，如疟疾、 病、莱什曼病等 。目前发现一种合成的天蚕素 作用的靶目标是细胞质膜，它可以快速降低 H 和 的通透性，破坏膜电势，质膜形态也受到损坏。 1998）研究发现昆虫抗菌