从基因表达谱到蛋白质相互作用——系统性红斑狼疮免疫通路的解析

从基因表达谱到蛋白质相互作用系统性红斑狼疮免疫通路的解析上海第二医科大学博士学位论文从基因表达谱到蛋白质相互作用系统性红斑狼疮免疫通路的解析姓名叶霜申请学位级别博士专业内科学风湿病学指导教师顾越英200351上海第二医科大学博士学位论文摘要第一部分系统性红斑狼疮的基因表达谱及其免疫调控通路的研究目的通过基因表达谱勾画系统性红斑狼疮,发病机制中可能的免疫调控通路。方法用寡核苷酸基因芯片研究了例包括例同胞对和份正常对照的外周血白细胞基因表达谱。进行了基因表达谱和临床免疫表型的聚类分析和比较筛选统计学显著性差异表达的相关基因,并在转录和蛋白表达水平验证芯片表达谱结果。结果聚类分析揭示临床免疫表型与基因表达谱特征存在关联。获得个显著性差异表达的相关基因,其中大部分未经报道。应用荧光实时定量在转录水平用较大样本独立验证了其中/,在中的表达上调蛋白质水平验证了/的高表达。结论基因表达谱可能是其临床免疫表型的分子基础,结合一例以淋巴增殖为主要表现的特殊类型的个案分析,探讨了通过基因表达谱进行分型乃至鉴别诊断的可能性。通过显著性差异表达的相关基因,推测干扰素及其免疫调控通路在发病中可能扮演重要角色。第二部分系统性红斑狼疮相关基因的蛋白质相互作用目的干扰素诱导蛋白为第一部分基因表达谱研究中首次报道的相关基因。试图运用蛋白组学的策略研究的蛋白质相互作用,以揭示其可能的功能。方法荧光实时定量进一步验证外周血白细胞转录水平基因的表达应用分子克隆技术在大肠杆菌克隆并表达融合蛋白利用表达标签,以为饵蛋白捕获外周血白细胞蛋白裂解物中与存在相互作用的蛋白质,肽指纹图谱进行蛋白质鉴定。结果荧光实时定量证实基因确在例较正常对照例表达上调。克隆表达了,土鋈苤三匿型丕堂整主堂堡婆至融合蛋白,并捕获到一个与存在相互作用的蛋白质,经肽指纹图谱初步鉴定。结为/鸟瞟呤核苷交换因子/论是新的相关基因。运用蛋白组学的策略研究蛋白质水平的相互作用显示,与/鸟嘌呤核苷交换因子存在相互作用,可能通过该途径影响蛋白的活化,参与的发病。第三部分对小鼠自发性的免疫调节作用目的观察新型免疫抑制剂对自发性动物模型小鼠的治疗作用,并用芯片从基因表达调控角度考察可能作用的免疫通路。方法小鼠给与每次/灌胃,每周次从周龄起点动态评估血清滴度和肾脏组织病理学改变。用芯片检测脾脏单个核细胞基因表达谱。结果能够降低处理组模型血清的滴度,对模型小鼠免疫复合物性肾小球肾炎有明显的抑制作用。脾脏单个核细胞基因表达谱筛选到差异表达基因个,包括一批与细胞移行相关的、参与细胞骨架调节的基因。结论能够对狼疮模型起到抑制作用。表达谱数据支持主要是通过激活鞘氨醇一一磷酸卜,受体从而加速淋巴细胞重新分布的免疫调节作用机制,并提示该通路可能需要蛋白和钙调蛋白参与。可能成为区别于细胞毒免疫抑制剂的新的治疗药物。关键词红斑狼疮,系统性基因表达谱免疫通路干扰素蛋白质相互作用治疗三塑蔓三堕型塞堂堡主堂堡堡墨主要创新点,应用研究人类系统性红斑狼疮外周血基因表达谱,筛选到一批未经报道的相关基因,提示通路在发病中的重要作用并初步提示基因表达谱和临床免疫表型谱存在关联。文章发表于中华风湿病学杂志,月”。国外最早的同类工作见于,月【】,整合并发展了一套实用的大规模表达谱数据分析方法,以及转录组下游的功能基因组学研究策略。将一个表达谱分析筛选到的功能尚不清楚的诱导表达的相关基因,通过表达纯化标签捕获、并经质谱初步鉴定了,与/存在相互作用。该部分研究内容被接收【】,方法学内容部分发表于中华医学杂志,第期【】,用新型的免疫抑制/调节剂治疗自发性狼疮模型国外同类工作第一篇文献见于年,用于治疗小鼠】。通过小鼠脾脏单个核细胞基因表达谱的分析,支持主要是通过激活受体从而加速淋巴细胞重新分布的作用机制,并提示该通路可能需要蛋白和钙调蛋白参与。可能成为区别于细胞毒免疫抑制剂的新的治疗药物。,研究了一例以淋巴增殖为突出表现的狼疮样综合征的基因表达谱,可能是首例用协助临床诊断和鉴别诊断的案例。上海第二医科大学博士学位论文,/,/,/,上海第二医科大学博士学位论文,/,/上海第二医科大学博士学位论文,/,一,上海第二医科大学博士学位论文第部分系统性红斑狼疮的基因表达谱及其免疫调控通路的研究前言系统性红斑狼疮,是具有代表性的多系统受累的自身免疫病。其病因和发病机理未明。人类和狼疮鼠动物模型的全基因组扫描和易感基因精细定位的工作提示,的发病是多基因相互作用的结果。其免疫表型可能为个不同层次的病理途径的综合效应】对核抗原免疫耐受的丧失,参与基因位点如鼠,免疫调节紊乱,参与基因位点如,免疫效应阶段的终末器官损伤,参与基因位点如,图,涉及上述个层次的基因型的组合,构成了临床免疫表型的多样性。随着人类基因组计划的草图完成,生命科学的研究已经进入了后基因组时代。因此,进一步从基因表达调控全局性的考察的发病机制成为必须。堂。薰。一糍蛩慧苫墨翟。“。器鬻搿。自。电蛊图的免疫通路异常,土塑蔓三堕型丕堂堡圭堂堡造基基因芯片,又称为微阵列技术,为该研究需要提供了合适的高通量工具】。直到晚近,才有收录的人类基因表达谱的研究报道【。我们的研究策略是试图通过外周血白细胞基因表达谱,揭示临床免疫表型的多样性与基因表达谱特征的关联并筛选统计学显著性差异表达的相关基因,在独立验证上述结果的基础上,勾画可能的免疫调控通路和潜在的药物作用靶点以期最终干预的自身免疫过程研究策略路线图见。患者鞲正常对照外周血白细胞。脾脏单强个核细胞气一逆转录,够/、四胁,燕憾古硪拈艄飙徽。图基于表达谱的免疫通路和免疫调节研究策略材料与方法研究对象和标本来源来自上海第二医科大学附属仁济医院风湿病学科病房及门诊的中国汉族患者共例,均符合年推荐的分类标准【。其中男性例,女性例以字母编号/,其中为治疗后再次进行基因芯片检测,和为同胞对,平均年龄岁,另肴例以土塑蔓三匿型丕堂型主室焦堡塞淋巴增生为主要表现的狼疮样综合征患者,也进行了治疗前后的基因芯片检测/。每例病人均记录临床资料见表,并按量表【】进行病情评估例的积分范围,平均,在原量表基础上增加,低补体血症等项,共计项称之为,其中抗体滴度按,一,/分别记分为,。其余增加项目均按或记录无或有。以细胞为底物,记为分。另选取性别、年龄相匹配的正常对照完成张对照芯片。例临床表现分类表临床表现木系统症状疲劳、发热、消瘦等女女面部红斑或口鼻溃疡或光敏感皮肤血管炎关节痛/关节炎女广泛淋巴结病/肝脾肿大浆膜炎女肺脏累及胃肠道血管炎木肾炎贫血白细胞减少血小板减少女血沉增快术/减低本表根据积分表简并,并增加了有关自身抗体谱内容。病人排列顺序参照聚类分析结果图。为例以淋巴增生为主要表现的狼疮样综合征患者。示治疗后好转上海第二医科大学博士学位论文主要试剂和仪器基因芯片采用“寡核苷酸芯片,点阵共点见图,包括点空白对照、点阴性对照、点看家基因阳性对照,涵盖多数已知免疫相关基因见/。,、“、盐酸胍华美生物工程公司羊抗兔二抗同上兔抗/多抗兔抗人多抗作为内参照武汉博士德公司化学发光试剂液和液上海普飞生物技术有限公司荧光定量仪。、垂直/水平电泳槽同上分光光度计凝胶成像系统超声细胞粉碎机宁波新芝双头水浴摇床杂交箱同上/离心机上海第二医科大学博士学位论文同上探针的合成和芯片杂交基本流程为用提取患者或健康对照者外周血自细胞总,进而用完成逆转录,引物为带启动子的,并合成第二链。再利用启动子完成双链的体外转录,合成生物素标记的探针后与芯片杂交。具体步骤如下总的提取及质量检测抽取患者或健康对照者外周血均抗凝待检。用红细胞裂解液去除红细胞。提取白细胞的总按说明书操作。琼脂糖电泳检验质量。,分光光度计测总的浓度和纯度,浓度需达到要求的量,其/比值。生物素标记探针的合成逆转录合成单链解冻必需的试剂盒成分,混匀后放在冰上。加入下列成分成分体积总体积。孵育分钟,然后立即放在冰中。上海第二医科大学博士学位论文加入下列成分成分体积最后浓度总体积为轻轻混合,。孵育分钟。将反应管放在冰上终止反应。立即进行第二链的合成。合成第二链解冻必需的试剂盒成分,混匀后放在冰上。在冰上,将下列成分加入第一链反应管。成分体积“无酶水一一一最后体积轻轻混合,。孵育。加入的聚合酶。孵育。加入。上海第二医科大学博士学位论文消化在上述反应管中加入,消化。加入蛋白酶,消化。双链的纯化加入。剧烈振荡。离心,将上清转移入一新离心管。加入/。剧烈振荡。离心,将上清转移入一新离心管。加入。剧烈振荡。离心,将上清转移入一新离心管。加入/体积的和的溶液/倍体积的预冷至一。的。剧烈振荡后,放入一冰箱至少。,离心。小心去除上清液,加入,离心。小心去除上清液,室温下空气干燥。加入,水溶解。放入一。冰箱保存,或立即进行下列操作。体外转录合成生物素标记的探针在上述合成的中加入下列成分成分体积最后浓度枷占望墨三垦型丕堂熊主堂焦婆塞孵育。加入无酶水和,完全混合。加入等体积的/。剧烈振荡。离心,将上清转移入一新离心管。加入等体积的。剧烈振荡。离心,将上清转移入一新离心管。加入等体积的,混匀。一四分钟。,离心。加入水。除非立即杂交,一。保存。标记生物素探针的检测】将生物素标记的标本点到醛基化玻璃片上,室温干燥。在。上紫外光交联,室温下,加入的,缓冲液孵育。室温下,加入的孵育。将玻片放入锥形管中,加入,缓冲液洗涤。重复两次。加入。,室温孵育上鎏篓三蜃型盔堂堕主塑造塞一二二将玻片放入锥形管中,加入缓冲液洗涤。重复两次。洗涤干燥后使用扫描,得出图像。标记的探针与基因表达芯片杂交至。,悬浮所有沉积的物质。加热加入到生物素标记的探针管中,。加热,将探针裂解成。立即放入冰中,简要离心将样本收集到管底。加入的,混匀后加入杂交舱中,封闭后,在杂交箱。摇动杂交过夜。去除杂交舱,将芷片浸入装有洗液一,简单冲洗,转移入一新的装有洗液一的锥形管中。,在洗液一中摇动洗涤次。,在洗液二中摇动洗涤。,在洗液三中摇动洗涤。继续立即进行芯片的检测步骤,避免芯片干燥。基因芯片的检测和扫描芯片的检测室温下,首先将杂交芯片与在摇动下孵育。将芯片浸入充满水的锥形管中简要冲洗。室温下,将杂交芯片与在摇动下孵育。将芯片放入装有的锥形管中,室温中在摇动下洗涤。上海第二医科大学博士学位论文重复步骤两次。室温下,将杂交芯片与在摇动下孵育。将芯片浸入充满水的锥形管中简单冲洗。再将芯片放入装有的锥形管中,室温中在摇动下洗涤。重复步骤两次。室温下,将杂交芯片与“在摇动下孵育。将芯片浸入充满水的锥形管中简要冲洗。再将芯片放入装有的锥形管中,室温中在摇动下洗涤。重复步骤两次。将芯片浸入充满水的锥形管中简要冲洗将芯片放入锥形管中,离心,使芯片干燥。准备基因芯片扫描。基因芯片的图像扫描打开基因芯片激光共聚焦扫描仪主机。打开软件,并连接主机,预热激光管。将基因芯片插入扫描器中。设定并调整激光器波长、删、扫描区域、扫描象素等参数,以获得最佳的信噪比。图像扫描。完成荧光信号数据的采集和输出。土鎏篓三匿型丕兰堡主堂堡堡塞生物信息学表达谱数据分析商用主要应用工具软件完成表达谱数据分析。具体包括数据标准化所有基因点的荧光信号强度均预先去除背景信号,然后以每张芯片信号中位数进行标准化,即位于芯片的基因点的相对荧光强度基因点在芯片的荧光信号强度/在第张芯片上所有基因荧光信号强度的中位数。聚类分析采用相关。分析正常对照与患者组间比较使用/过程,并整合经典的倍差异分析和方法。分析流程见结果部分图表达谱数据的验证实时荧光定量转录水平验证表达谱数据独立验证了/,两个基因在病人中的转录表达/比较了和正常对照的表达,比较了和正常对照的表达。引物、探针序列如下一一一一一一一一一一一土造蔓三匿型盔堂堂主雯堡鎏塞反应体系在荧光定量仪上进行,。,分钟,分钟然后个循环,秒一,秒一,秒。荧光定量仪采集待测基因及内参照扩增各循环荧光信号,软件完成。软件分析其值,并计算。两独立样本检验由化学发光,验证/的蛋白质表达抽提外周血白细胞用于芯片检测后,继续用盐酸胍一乙醇抽提蛋白质按说明书操作,溶解,经超声振荡后/蛋白定量。加入等体积上样缓冲液,煮沸分钟,电泳。经电转移至硝酸纤维膜上。羊血清封闭小时,加入兔抗/多抗,和兔抗人多抗作为内参照。孵育小时。充分洗涤分钟次,羊抗兔二抗,。孵育小时。充分洗涤分钟次。至暗室中时混合的等体积化学发光试剂液和液,反应分钟后弃去,胶片曝光一秒,冲洗显影。结果的基因表达谱分析结果基于基因表达谱的病人的聚类图和基于临床免疫表型的病人的聚类图结果均显示相同病人重复检测,尽管经过治疗上海第二医科大学博士学位论文病情获得部分缓解,仍聚于一类遗传背景相同的同胞对亦被聚于一类即/,和分别被聚在一起。而以皮肤黏膜损害、浆膜炎为主要表现,内脏受累较轻的患者、被聚在表达谱/或表型谱的一端特殊类型的以淋巴增殖为主要表现的狼疮样综合征患者和有胃肠道血管炎表现的患者被聚在另一端居于中间的患者多有血液系统及狼疮性肾炎等内脏受累临床资料见表。基因表达谱和临床免疫表型聚类之间显示了一定的一致性。换言之,的临床免疫表型和基因表达谱之间存在某种关联。圈回图基于基因表达谱的病人的聚类。基于临床免疫表型的病人的聚类。例病人编号/,/,其中,和分别为与经治疗后再次基因芯片检测,为一例以淋巴增殖为主要表现的狼疮样综合征和为同胞对。为正常对照。临床免疫表型和基因表达谱聚类之间存在一定的关联。销二茹然占墼匿型态堂整圭堂照堡塞图一张患者寡核替酸基因芯片。点,表达谱信号匿图寡核苷酸基因芯片实验重复性稳阏采源静蕊融合成探针与张芯片杂交鞠关系数铴,毽仍有,豹基因鼗示倍以上的差异。上海第二医科大学博士学位论文相关显著性差异表达基因分析全部点均视作独立基因数据处理,最后获得的差异表达基因列表的有效性应满足以下基本条件空白对照点不应出现,阴性对照点不应出现,看家基因对照点不应出现,复点基因应同时出现或同时不出现。,因/不具备代表性不含与正常对照芯片各基因点点/芯片经每张芯片的信号中位数校正后用/过程组间比较,然后分别经经典的倍差异分析和方法软件提供,获得非冗余的个相关显著性差异表达基因分析流程见图,且满足上述有效性基本条件个基因列表见表。图表达谱数据分析流程图/倍差异表达和方法分析结果基本一致,即前一方法的点均包含于后一方法获得的点,而点中有个基因在芯片上足复点。整合重复基因后得到个非冗余基因。占婆笺三蜃型丕堂堡主里堡堡塞奏量星坚匡堂过盟星董堂蕉墨室鲨蕉旦注释号通用名相对表达水平上述个基因为正常对照统计显著性,且较正常对照表达上调或下调倍以上的基因。为重复出现次基因,其值取次均数的基因表达谱数据的验证结果较大样本独立验证了/,两个基因在病人中的转录表达,结果显示/在中较正常对照袭达上调在中亦较正常对照表达上调见图。土鎏墨三堡型丕堂型主堂望篁圣图表达谱数据转录水平的独立验证。荧光实时定量验证了/在中较正常对照表达上调在中亦较正常对照表达上调。负值越高表示该基因拷贝数越高。显示/蛋白水平在较正常人表达增加。有趣的是在家系中,同胞对,的/表达上调,未发病的正常姐妹,的/也有不同程度的增加。父母双方该蛋白表达与正常人类似图。图,化学发光检测中/蛋白质表达。左分子量,考马斯亮蓝染色,中较正常人/表达增加。右在家系中,同胞对,的/表达上调,正常姐妹,的/也有不同程度的增加。父母双方/表达与正常人类似。正常对照一家系同胞父母。讨论技术平台的建立与评估技术为全局性的研究基因表达调控提供了高通量的工具,并土塑萋三匡型丕掌整主室堡婆塞较大程度上避免了研究上的主观性偏差【。因是非组织特异性的系统性自身免疫病,故本研究采用了含有大量免疫效应细胞的外周血细胞作为表达谱研究的材料。实验室的大规模芯片数据总结表明【“,外周血细胞的基因表达谱与相一致,疾病外周血细胞的表达谱特征能够和正常人群区分开来尽管正常人群中表达谱也存在变异为我们的研究提供了可行性方面的佐证。本研究建立了基于寡核苷酸芯片基因表达谱分析的技术平台包括探针合成、杂交一芯片扫描一大规模表达谱数据分析一表达谱数据在转录和蛋白水平的验证。寡核苷酸芯片使用端序列特异性基因片段作为靶基因,含量一致,退火温度恒定,探针用单色荧光标记,不存在双色标记效率差异等问题,特异性优于芯片。重复性预试验表明,相同来源的总合成探针与张芯片杂交相关系数可达,但仍有的基因显示倍以上的差异图。因此,除严格控制实验条件和加强验证工作外,增加样本和必要的统计学检验是保证芯片数据可靠性的必要条件。在分析中我们引入了基于过程的检验并联合采用了经典的倍差异筛选方法,并与方法对照,结果基本一致。值得一提的是,经典的倍差异筛选方法的可靠性已经受到质疑【,我们并未摒弃该方法,但在分析和讨论中结合了必要的统计学检验指标,以使结果更有说服力。上述方法获得了非冗余的个相关显著性差异表达基因。用荧光定量较大样本对其中/,两个基因进行了独立验证/更在蛋白质水平验证了其在中的高表达。初步证实了上述方法获得的表达谱数据的有效性。但是,严格的尺度固然减少了假阳性的结果,势必同时增加了假阴性。从基因表达调控全局考虑,我们获得的阳性结果可能是免疫调控通路“瀑布”式反应下游的放大效应,而启动自身免疫的关键性上游基因可能未被筛出。我们相应的对策是从较为坚实的立足点出发,“顺藤摸瓜”式的推演可能的免疫调控通路而避免过多假阳性结果的误导。上海第二医科大学博士学位论文图以淋巴增殖为主要表现的病人的基因表达显示细胞凋亡活跃。上海第二医科大学博士学位论文的表达谱和临床免疫表型聚类分析及个案研究应用基因表达谱对疾病亚型进行分类的尝试仅见于白血病和淋巴瘤的相关研究。素以临床表现多样性著称,本研究初步提示外周血白细胞的基因表达谱的聚类与临床免疫表型存在某种关联。而前者可能是后者的分子基础。由于样本较小,远不能覆盖临床免疫表型的多样性,因此探讨通过基因表达谱特征进行分子水平的疾病分类乃至诊断和鉴别诊断还为时尚早但作为一种尝试,仍提示了未来风湿病学可能的发展方向。对以淋巴增殖为主要表现的狼疮样综合征的临床和基因表达谱的个案分析,即为我们提供了有益的资料积累患者,女性,岁,全身淋巴结肿大年,并有肝脾肿大及肺内多发结节影图。年前出现面部蝶形红斑,查,抗抗体,。先后次淋巴结活检均提示“非特异性炎症”,不支持病,血管性免疫母细胞性淋巴腺病病程长且呈良性经过,可排除淋巴瘤免疫蛋白电泳无单株免疫球蛋白,不支持有关浆细胞病流式细胞仪细胞亚群无双阴性细胞增多,不支持自身免疫性淋巴增殖综合征】,】。在先天发病的狼疮样综合征动物模型中/与品系就是以淋巴增殖为主要表现,现已明确上述模型分别存在和基因的缺陷。患者是否存在/,或其他凋亡相关基因的表达异常表达谱分析结果显示患者的凋亡基因表达活跃图,包括/,等一系列加速细胞凋亡的基因均上调表达,进一步排除了类似凋亡基因缺陷综合征的诊断。复习文献仅有一例患者被确定存在突变”】,多数报道均提示人类不同于/和模型,即人类的淋巴细胞凋亡呈加速状态,并推测人类的自身免疫与凋亡导致大量核抗原暴露和递呈有关”。该患者表达谱表达上调基因中已知与相关、或免疫相关的基因还包括,占塑蔓三匡型丕堂堡主兰堡婆塞一一,等,下调基因有,一,等。在例中显著性差异表达的,在本例中亦有升高。总之,结合该患者的临床免疫表型和基因表达谱,该患者可能为的一种特殊类型,值得进一步随访并积累类似病例,进行深入研究。有趣的是位于类分子区域可能与凋亡产物的清除有关的基因博】在该患者呈下调。但是其凋亡亢进究竟为始动因素还是继发性改变,在个案中尚难以确定。相关的显著性差异表达基因和免疫调控通路差异表达基因的聚类分析大致上显示了三组相关基因诱导表达基因图,急性时相反应相关基因,下调基因。聚于一类的相关基因包括一组诱导表达蛋白、。其中,即一一主要是由型诱导表达,目前认为其主要功能为抗病毒作用,并已有在患者血清中检出该酶的报道】。型和型均可诱导表达、。有作者在对的小鼠模型基因芯片表达谱研究中发现。,诱导表达的可能是易感基因,并认为有希望成为治疗的候选药物靶点。对人、和小鼠基因的序列比对未发现同源性,我们认为更审慎的结论是家族特别是型及其免疫调控通路可能在发病中扮演重要角色,我们表达谱数据筛选到的个基因中,和均显示上调趋势,表达水平分别为,也存在上调趋势,值。等【发现。病人血清可以诱导正常的单核细胞使之分化为树突状细胞,而在血清中发挥作用的正是,加入抗抗体可以使诱导作用消失。被诱导的树突状细胞可捕获凋亡细胞和核小体,行使抗原递呈作用,最终导致免疫耐受的打破和自身免疫的发生。而抗/抗核小体的抗原抗体复合物本身又是强有力的诱导物,上海第二医科大学博士学位论文从而构成了一个以抗原递呈细胞一一核抗原为轴心的相互作用的反馈环路。我们获得的其他与相关的差异表达基因还包括,它也具有干扰素刺激反应元件。该基因通常不表达。于外周血成熟的淋巴细胞表面,而可以作为淋巴细胞增生活化的标志【。一调节的核因子在中表达上调,可能在调控通路中发挥协同作用。已知在可以协同,使单核细胞诱导转化为树突状细胞的作用得到强化【。是一组参与胞内信号转导的重要分子,及相互作用因子,上调,可能也间接参与了通路信号转导的调控。晚近等【】发表了外周血表达谱的同类工作,同样发现存在通路的异常亦有,等基因的上调。但是与该文研究对象主要为重型不同,我们的例主要为初发、轻中度活动、无终末脏器功能障碍的患者虽然样本相对较少,但似更具代表性、更少医源性干预因素的影响而在此情况下,两个跨人种的独立研究均指向通路的结果,更说明该通路在发病机制中的普遍性。图个相关的显著性差异表达基因的聚类分析,亮化显示的起孬覆菜于一类的诱导表达的基因。土鎏釜三匡型盔堂搜主室堡婆墨我们还得到乳铁蛋白,基质金属蛋白酶,粘附分子等基因在表达上调,提示非特异的急性时相炎症反应的存在。同样高表达的急性时,可能是重要的相反应调节因子/调控环节,分析/证实上述三个基因和其他多种急性时相反应分子均有/的顺式作用元件,可受到/的转录调控。一可直接诱导的表达,一又是已知的可能与相关的淋巴细胞增生活化的刺激因子我们的结果在中表达为,/在类细胞中的表达占优,与/同源的/则直接受到的调控,/和/之间、/和及等其他转录因子均存在相互作用【,因此/可能在免疫调控通路上发挥一定的作用。本研究中初发未用药物的/仍呈高表达,而家系中/蛋白表达除在例同胞中增高外,另例未发病姐妹无激素使用史也存在增高,初步排除了/在中的高表达是由糖皮质激素引起的可能性【】。而/在家系中的表达,又进一步提示/并非发病的充分条件。急性时相反应蛋白对外来抗原及抗原抗体复合物的清除起到重要作用,已经证实急性时相反应蛋白血清淀粉样蛋白在自身核抗原的加工和清除中有重要意义,的缺陷可能导致对自身核抗原的免疫耐受丧失【。/与的关系尚不清楚,但分析显示无/的调控元件。不除外如下可能/介导的急性时相反应向不利于或类似物表达的方向偏移,增加了机体自身核抗原的负荷,形成另一个自身抗原清除障碍的反馈环路。上述假说只有在对相关候选靶分子在蛋白质水平的相互作用和免疫调控通路的研究得到细化后,才有可能得到阐明。总之,通过对的基因表达谱研究,初步揭示了临床免疫表型与表达谱特征存在关联筛选了显著性差异表达的相关基因,在此基础上勾画了及其相关的免疫调控通路在可能扮演重要角色,为进一步阐明的免疫调上海第二医科大学博士学位论文控机制和寻找药物作用靶点打下了基础。上浸笺三蜃型丕堂型主堂焦查塞第二部分系统性红斑狼疮相关基因的蛋白质相互作用前言已有证据表明,干扰素,家族特别是型及其免疫调控通路可能在发病中扮演重要角色【。】。在第一部分研究中,我们用寡核苷酸芯片筛选到一批诱导表达的相关基因,其中为首次报道的相关候选基因,但其功能未明。本部分研究试图进一步证实该基因在转录水平的高表达,并运用蛋白组学的策略研究蛋白质水平的相互作用,以揭示其可能的功能。蛋白质相互作用已经成为晚近蛋白组学的研究热点。新的研究策略大体是,将目的蛋白克隆表达并利用上游表位纯化标签,捕获相互作用的蛋白复合体,如等应用串联亲和纯化策略,用以纯化并鉴定酵母蛋白质复合物见示意图等】则用进行了类似的研究均绕开了二维凝胶电泳和酵母双杂交等经典而复杂的方法,宜接通过生物质谱技术鉴定相互作用的蛋白质,甚至发现新的蛋白质。基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱和电喷雾电离串联质谱具有高分辨率和高质量精度的特点,可以满足蛋白质相互作用研究的技术需要,已成为蛋白组学重要的工具。图串联亲和纯化的蛋白质相互作用研究策略示意图,上海第二医科大学博士学位论文我们采用上述研究策略,对既往用于研究已知蛋白质之间相互作用的拉下方法【】进行了改良,用以发现未知的作用蛋白。试验材料和方法材料,表达宿主菌质粒,感受态克隆宿主菌菌株均为本实验室保存表实验主要仪器仪器名称型号生产厂家超低温冰箱公司制冰机同上旋涡混合器型江苏海门市麒麟医用仪器大容量恒温振型江苏太仓实验设备厂高速离心机“一公司公司公司稳压稳流电泳,型北京六仪器厂垂直电泳仪公司凝胶成象系统刖精密恒温仪北京冷翠技术开发有限公超声细胞粉碎一宁波新芝科器研究所酸度计公司超纯水仪,超滤器电子天平上海天平仪器厂紫外分光光度型,热循环仪公司冷库公司水平摇床通达科技超净工作台北京半导体设备一厂上海第二医科大学博士学位论文表实验主要试剂盒生产厂家试剂名称,同上逆转录试剂盒公司多聚酶内切酶,内切酶同上同上连接酶同上快速纯化/回收试剂盒北京鼎国生物试剂公司琼脂糖凝胶回收试剂盒,公司还原型谷胱甘肽分子量的蛋白质浓缩管公司,上海生工生物工程有限公司分装,上海生工生物工程有限公分装考马斯亮蓝一,北京鼎国生物技术有限公司考马斯亮兰上海化学试剂公司分装巯基乙醇,公司葡萄糖