体外分析技术

1、体外分析技术昆明医学院第二临床学院 杨青 副教授 第四章 体外分析技术本课内容概 论第一节放射免疫分析第二节免疫放射分析法第三节 其他体外放射分析法第四节 非放射性标记免疫分析技术概念体外分析技术（in vitro assay）是指在体外，即在反应管中对生物活性物质进行超微量分析的技术。体外放射分析（in vitiro radioassay）是指在体外条件下，以放射性核素(radionuclide)标记的配体（ligand）为示踪剂，以竞争或非竞争性免疫结合反应为基础，以放射性测量为定量手段，对各种微量生物活性物质进行检测的一类核医学检测方法。Berson & YalowBerson

2、& Yalow1960年美国的Berson和Yalow 将核技术与免疫学技术结合建立了放射免疫分析法。首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了Nobel Prize。History reviewRadioimmunoassay发展免疫结合反应由竞争性免疫结合反应非竞争性免疫结合反应放射性核素标记配体的免疫分析非放射性核素标记配体的免疫分析体外分析技术的特点为1、灵敏度高可测水平10-910-20 。 一般化学分析法检出极限为10-310-6 2、特异性强具有良好的特异结合试剂，能识别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体，例：能识别T3、

3、T4、RT3（T4脱去外环上第5位上的碘-T3，脱去内环上第5位上的碘-RT3）；能准确测定生物活性物质的亚单位浓度。3、精密度高反映出来的是随机误差小（统计及实验误差）。4、应用广泛以放射免疫分析法为例目前至少有300多种生物活性物质的第一节放射免疫分析第一节放射免疫分析（一）（一）基本原理基本原理竞争性结合反应的经竞争性结合反应的经典标记抗原（典标记抗原（AgAg* *）和）和非标记抗原（非标记抗原（AgAg）与限）与限量抗体量抗体(Ab)(Ab)竞争性结合竞争性结合AgAg* *和和AgAg具有等同的具有等同的与与AbAb结合能力结合能力AbAb限量，限量，AgAg* *定量定量, ,A

4、gAg* *和和AgAg的量大于的量大于AbAb结合位点，二者结合位点，二者通过竞争方式与通过竞争方式与AbAb结合；随着结合；随着AgAg增加，增加，AgAg* *与与AbAb结合形成结合形成AgAg* *AbAb复合复合物的放物的放射量降低射量降低, ,二者变化二者变化成函数关系。成函数关系。 抗原抗体反应抗原抗体反应AgAg* *AgAg反应条件反应条件体积体积温度温度时间时间pHpHAbAb( (标准标准Ag/Ag/样品样品Ag)Ag)平衡平衡非平衡非平衡一步法一步法二步法二步法以未结合的以未结合的AgAg* *为为F F，AgAg* *AbAb复合物复合物为为B B，则，则B/FB/

5、F或或B/(BB/(BF)F)与与AgAg的的量变存在着函数量变存在着函数关系剂量反应关系剂量反应曲线曲线 注：注：T即是即是B与与F的总和的总和( (二) ) 标准曲线 (standard carve)(standard carve)制作方法：1. 配制一系列已知浓度的标准抗原Ag的反应管，并标明浓度；2.分别向反应管中加入固定量的*Ag、Ab；3.经过一定时间的温育竞争结合反应；4.待竞争结合反应平衡后，分离结合B（Bond）部分和游离F(Free)部分；5.用放射性探测器测得*Ag-Ab放射性为B或游离*Ag的放射性为F；6.计算出结合率B%B/（B+F）100，或B/B0%；B0为不含

6、Ag的结合率，因Ag为“0”，故B0 *Ag-Ab的结合率为最大结合率；7.以B%或B/B0为纵坐标，标准抗原浓度为横坐标，绘制出B%或B/B0随Ag量变化的曲线即为标准曲线（图4-2）。RIA的必备条件包括由国家批准的生产单位提供的试剂、分离技术、测量仪器。主要试剂的组成是：特异性抗体(specificantibody)、标记抗原（radionuclide labeled antigen）、标准品（standard）（非标记抗原）。第一节放射免疫分析第一节放射免疫分析（一）必备条件（一）必备条件( (一) ) 特异性抗体(specific antibody)(specific antibod

7、y)以被测物质为抗原注入动物体内，一定时间后在动物血清中即可获得能与该抗原特异性结合的抗体，即为特异性抗体，而含有该抗体的血清称为抗血清（anriserum）。在免疫过程中分子量5,000的多肽和蛋白质才能产生抗体， 分子量5,000的肽类物质，需要与载体蛋白结合才能产生抗体。免疫动物产生的抗血清不一定都适合放射免疫分析，需选择亲合力（affinity）大、滴度(titer)高、特异性（specificity）强者使用。1.亲和力（affinity） 是免疫反应中抗体和抗原之间相互作用的一种结合能力和强度。亲和力大则免疫结合速度快、牢固。亲和力大小以亲和常数Ka值来判断，一般要求在101010

8、12L/M之间。2.抗体的特异性（specificity） 是指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物的结合能力的比较。抗体与抗原结构类似物的结合称为交叉反应（cross reaction），抗体的特异性由此来判断，交叉反应越小越好。3.抗血清滴度(antiserum titer) 是以免疫反应中所需抗血清（antiserum）稀释度的倒数来表示。稀释倍数越高，滴度也就越高，表示抗体的效价越高。1.放射性核素标记的抗原（radionuclide labeled antigen，*Ag） 要求高纯度的抗原，其纯度直接影响方法的特异性、准确度及灵敏度。因此尽可能的提纯和纯化。2.标记抗原的放射性核素主

9、要用125I和3H标记。临床多用125I标记多肽类激素及蛋白质。3H则标记小分子化合物。第一节放射免疫分析第一节放射免疫分析( (二二) ) 标记抗原标记抗原3.3.对标记抗原的要求（1）比活度（specific activity）高而适当比活度是指每微克抗原上标记的放射性核素的千贝克数（kBg/ug）,其直接影响方法的灵敏度。（2）免疫活性（immune activity）在标记或是蓄存过程中，可能由于外界条件的变化而造成标记抗原的损伤并使其活性下降,造成与抗体反应的能力减弱甚至丧失。蛋白质分子上标记过多的碘原子也会引起免疫活性的改变，（3）放化纯度(radiochemical purity

10、)是指具有免疫活性的标记抗原总放射性的百分数，放化纯度应大于95%。若放射性杂质多，会影响测量的精确度。（4）便于放射性测量（radionuclidecounter）多采用发射低能光子的125I标记抗原便于进行测量。3H标记抗原则需用液体闪烁计数器测定。（三） 标准品标准品（standard）即标准抗原(standard antigen)，用于制作标准曲线，是放射免疫分析（RIA）的定量基础，其质和量的变化会直接影响样品的测定值。对标准品的要求是：1.应选用高纯度的不含杂质的抗原做标准；2.采用化学结构、免疫活性都与被测抗原一致的抗原做标准；3. 标准定量一定要精确。（四） 分离技术分离技术（

11、separation technique）是用于放射免疫分析中，当抗原、抗体反应达平衡后，必须将游离抗原及结合抗原进行分离，然后分别测定其放射性的方法。1.双抗体法（double antibody method）2.沉淀法(precipitation method) 也称PEG法3.双抗体法沉淀法（double antibody method precipitation method）4.吸附法(adsorptive method)5.固相法(solid phase method)（五） 测量仪器1. 射线探测器（免疫计数器）2.液体闪烁计数器(liquid scintillation cou

12、nter)放射免疫分析的测定方法(determination)一般包括加样、孵育、分离、测量、数据处理五个步骤。第一节放射免疫分析第一节放射免疫分析三、三、 测定方法测定方法又称为试剂盒质量和方法学评价（质量保证），包括合格的试剂盒和操作方法。（一） 精密度（precision）又叫重复性，是对已知的同一样品重复测定结果的一致程度。(二) 准确度(accuray)指测定值接近“真值”的程度。用测定样品中外加标准品的回收率来判定。（三） 灵敏度(sensitivity)指最小可测出量（可检出的最小浓度）。（四） 特异性(specificity)取决于抗体的特异性，用交叉反应来判断。交叉反应（cr

13、oss reaction）越小，特异性越好。（五） 可靠性又称健全性(perfecty)，评价被测物与标准品的免疫活性是否相同的指标。第一节放射免疫分析第一节放射免疫分析四、四、 主要技术指标主要技术指标五、 质量控制质量控制(quality control,QC)是对分析工作中的误差进行经常性的检查,遇有质量异常则及时采取对策,以保证分析误差控制在可接受的范围。质量控制包括：实验室内部质控和实验室间质控。实验室内部质控分为批内质控及批间质控。免疫放射分析法（Immunoradiometric assay, IRMA）是1968年由Miles 和Hiles应用125I标记牛血清胰岛素获得成功而

14、建立的，到70年代中期单克隆抗体(McAb)的制备技术问世以来，免疫放射分析法的分析技术得到突破性的发展，使体外放射分析的灵敏度和精确度不断提高，应用迅速推广。第二节免疫放射分析法第二节免疫放射分析法（Immunoradiometric assay, IRMAImmunoradiometric assay, IRMA）一、 原理 二、试剂IRMAIRMA与与RIARIA的主要区别表的主要区别表 IRMAIRMA与与RIARIA的主要区别表的主要区别表 1.直接法（direct method）Ag+*Ab Ag-*Ab + *Ab2.夹心法 (sandwich method) 一般为固相法Ab1

15、(固相) +Ag +*Ab2 Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2三、测定方法）三、测定方法）四、免疫放射分析法的特点1.反应动力学 在抗原与抗体的反应中,反应速度与反应物浓度呈正比, IRMA标记的单克隆抗体是过量的, 且反应是非竞争性的全量免疫结合反应,故比RIA反应速度快,一般23小时即达到平衡。2.灵敏度 与零剂量的计数误差有关。IRMA的零剂量的反应值是非特异性结合，如果有接近零水平的抗原与固相结合，标记抗体就应与其结合形成复合物，只要标记复合物的放射性测量值超过非特异性反应，就应被检测出。因此，只要将非特异性反应控制在最小值，IRMA的灵敏度就会明显比RIA的高。3.特异性 IRM

16、A法所用的固相抗体和标记抗体是分别针对抗原不同的抗原决定簇的单克隆抗体，不易发生一般的交叉反应，所以特异性较强。4.稳定性 在免疫反应中有些抗原抗体间的亲和常数K值有明显的温度依赖性，降低温度有利于K值的提高，从而增加灵敏度。但当有过量抗体时，由温度带来的K值的变化对实验的影响较小。另外，IRMA法中待测物先与固相抗体结合，洗涤后再加标记抗体，这样已除去了样品中大部分杂质对反应系统的干扰，所以稳定性好。5.标准曲线的工作范围 IRMA的工作范围较宽，在一般情况下，待测物含量低者不必浓缩，高者不必稀释，同样也就避免了由此带来的误差。6.缺点IRMA对蛋白质和多肽抗原检测是优越的，但需要的抗原至少

17、具备两个抗原决定簇，这就限定了它对短肽及其它半抗原活性物的测定。第三节 其他体外放射分析法一、放射性受体分析方法放射性受体分析法（Radioreceptor assay，RRA）是放射性核素标记的配体(ligand)与相应的受体进行特异性结合的方法。用细胞受体蛋白作为结合剂，根据受体可与配体（如激素、介质、药物）进行特异性结合的特点，测定的是结合的配体复合物的放射性计数，而达到对受体进行定量的分析RRA是代表配体与受体之间的生物活性，不是免疫活性(二) 测定方法(三) 临床应用1受体病的机理研究和治疗预后判断。举例：对糖尿病患者的研究：胰岛素正常，血糖高者在受体研究中发现体内缺乏受体结合点而胰

18、岛素无法发挥作用。2为治疗提供依据。如癌组织内有相应受体者，术后可采取相应激素治疗。二、 竞争性蛋白质结合分析法竞争性蛋白质结合分析法(Competitive protein binding assay,CPBA)是一种以血清中的激素结合蛋白代替抗体或受体作为结合剂对激素等生物活性物质进行定量分析的技术。三、 酶放射分析法酶放射分析法（Radiometric assay of enzymatic,REA）是建立在酶促反应条件下，用放射性核素标记酶的底物进行酶的活力测定。即以特异酶作为结合剂，通过测定标记产物的放射性来反映待测酶的活性的一种分析方法。如蛋白激酶测定环核苷酸。四、 放射微生物分析法

19、放射微生物分析法(Radiomicrobiologic assay)以特异微生物作为结合剂的分析方法。如用某种微生物测定叶酸。第四节 非放射性标记免疫分析技术unradiolabeled immunoassayunradiolabeled immunoassay）40多年前，Berson 和Yalow 建立了放射免疫分析的方法，实现了对血清中胰岛素的定量测定，这是标记免疫分析技术的一个里程碑，这一方法很快被用于其他激素的测定，从而改革了内分泌疾病的实验室诊断技术。1977年诺贝尔生理学及医学奖一、 时间分辨荧光免疫分析（一） 原理 时间分辨荧光免疫分析法（time- resolved fluo

20、rescence, TRF）是以镧系元素铕（Eu）、铽(Tb)、镝（Dy）、钐（Sm）作为标记物标记抗原或是抗体的方法。镧系元素能发射出离子荧光，当抗原抗体结合反应形成复合物后，用时间分辨荧光免疫分析仪测定其最后产物中荧光强度，其光的强度随时间呈指数方式下降，并随着荧光衰变速度的增加而减弱，衰变速度快者激发后瞬间即测得，而慢者则延迟一定的时间后方能测得。在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化根据镧系元素螯合物的

21、发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。( (二) ) 试剂组成 1.镧系元素-标记的抗体或标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。2.固相抗体或抗原固相载体多用聚苯乙烯微孔条。包被的抗原纯度要高，抗体效价要高，亲和力强。3.增强液若试剂纯度不高、不明原因的污染，均可导致增强液荧光本底升高。4.标准品用于制作计量反应曲线，标准品的浓度应用法定标准物为基准进行过标定。5.质量控制样品同放射免疫部分。二 化学发光免疫分析法(一) 原理化学发光免疫分析法（chemical luminescent immun

22、oassay，CLIA）是用某些化合物分子（发光物质）作为标记物标记抗原或抗体,当化合物分子被氧化后可以形成激发态，激发态返回基态的同时发射出光子,相应的接收系统接受光信息并转变为数据信息。化学发光免疫分析法是将具有高灵敏度的化学发光技术与高度特异性的抗原抗体免疫反应结合起来的一种超微量的分析法。其突出特点是设备简单，试剂稳定，无放射性污染。发光发光Y YY磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带丫啶酯带丫啶酯标记物抗标记物抗体体YYYYYYYYYYY冲洗后冲洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化学发光的机理直接化学发光的机理1. 化学发光免疫分析（chemical luminescent immunoassay，CLIA）2. 酶增强化学发光免疫分析(enhaced chemiluminescence enzyme immunoassay, ECLEA)3. 电化学发光免疫分析(elrochemiluminescence immunoassay, ECLIA) 三 酶标记的免疫分析法原理 :酶标记的免疫分析法（enzyme immunoassay, EIA）是酶标记抗体或抗原的免疫检测方法。该方法是将抗原抗体结合的高特异性与