基因工程实验指导书2

1、基因工程实验手册目 录实验一、质粒DNA的提取实验二、细菌基因组的提取实验三 DNA的限制性内切酶解及电泳实验四、PCR基因扩增及电泳实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验一、质粒DNA的提取质粒是一种双链的共价闭合环状的DNA分子,是细胞染色体外能够稳定遗传的因子。在基因克隆的实验中,要把一个有用的外源基因通过重组DNA技术,送进生物细胞中去繁殖和表达。实现携带外源基因进入受体细胞的工具被称为载体,细菌质粒是基因工程中常用的载体之一。作为基因工程的载体需具备下列条件:（1）是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖;(2)载体在受体细胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源

2、基因在受体细胞中大量扩增；3)载体DNA链上有一至数个限制性内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;(4)载体具有选择的遗传标记,如抗氨苄青霉素基因(AmpR,抗新霉素基因(NeoR)等,以此判断载体是否进入受体细胞,并据此将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来.细菌质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:严密控制型和松驰控制型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,与染色体复制相关联,每个细胞只含有一个或几个质粒分子,如ColEI质粒(含有产生大肠杆菌毒素EI基因),pBR322就是ColEI衍生的质粒。后者在整个细胞周期中随时可以复制,具多拷贝,一般在120个以上。本实验分离纯化的质粒为p

3、QE30,为高拷贝质粒。通过本实验学习了解质粒DNA的特点,掌握碱性SDS快速法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA.一、实验原理 所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤:细菌培养物的生长;细菌的收获和裂解;质粒DNA的纯化。本实验以碱性SDS快速法小量制备pQE30质粒。碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是,加溶菌酶可破坏菌体细胞壁(小量制备可省略不用溶菌酶),去污剂SDS可使细胞壁裂解,并使蛋白质变性,在碱性条件下,破坏碱基配对,故可使宿主的线状染色体DNA变性,但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时(加入酸性试剂中和),质粒DN

4、A链迅速得到准确配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中,乙醇沉淀后可得到质粒DNA.如需进一步纯化,可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型:当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共价闭合环状DNA(CCCDNA),这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型;如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构,另一条出现有一至数个缺口时,称之为开环DNA(OCDNA),此即OC构型;若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后,发生双链断裂而形成线性分子(LD

5、NA),通称L构型。质粒DNAMr一般在106107之间,常以kb表示(lkb双链DNA=6.6×105),如质粒pUC19的Mr为1.8×106(2.69kb)。在琼脂糖凝胶电泳中,不同构型的同一种质粒DNA,尽管M相同,仍具有不同的电泳迁移率,其中走在最前沿的是scDNA,其后依次为LDNA和ocDNA。二 仪器、材料与试剂(一)仪器1. 恒温培养箱2. 恒温摇床3. 台式离心机4. 高压灭菌锅(二)材料1.葡萄糖2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氢氧化钠5.十二烷基硫酸钠(SDS)6.乙酸钾7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇10.RNA酶11.氨

6、苄青霉素12.蔗糖13.溴酚蓝14.酚15. 8一羟基喹琳16. 一巯基乙醇17.盐酸(HCl)18.含pUC19质粒的大肠杆菌19.吸头、小指管(三)试剂1.溶液I50 mmol/L 葡萄糖5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCL(pH8.0)10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)2.溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合3.溶液III5mol/L乙酸钾 60 mL冰乙酸 11.5 mL水 28.5 mL4.TE缓冲液l0 mmol/L Tris-HCI1 mmol/L EDTA(pH8.0)5 70%乙醇(放-20冰箱中,用后

7、即放回)6.、膜RNA酶将RNA酶溶于10mmol/LTris-HCI(pH7.5)、15mmol/LNaCL中,配成10mg/mL的浓度,于100加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20。7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴酚兰8.酚。三 实验步骤1.将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中,接入上述的含pQE30质粒的大肠杆菌,37振荡培养过夜。2.取1.5mL培养物倒入微量离心管中10000r/min离心2min.3.吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。4.将细菌沉淀悬浮于100L溶液I中，充分混匀室温放置10min。5.加200L溶液II(新鲜配制)，盖紧管口，混匀内容物，将

8、离心管放冰上5min。6.加入150L溶液III(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上15 min。7.12000r/min离心15min将上清转移到另一离心管中。8.向上清中加人等体积酚:氯仿(1:1)(去蛋白),反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后室温放置510min. 12000r/min，离心5min.倒去上清液,把离合管倒扣在吸水纸上,吸干液体。10.加入20TE缓冲液,使DNA完全溶解,-4保存。四 实验安排本实验一天内可做完。实验结果可结合下一个实验一起观察。五、讨论1.细胞的裂解作用是分离质粒DNA实验

9、操作的关键步骤。通常是加入溶菌酶或SDS来促使大肠杆菌细胞裂解的。如果寄主细胞没有完全裂解,就会显著降低质粒DNA的回收率。理想的状况是使每一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出,而又没有污染过多的染色体分子。2.提取过程中,除规定的实验条件外,应尽量保持低温,避免过酸过碱,操作中手法要温和,防止机械剪切,尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA的降解和破坏。3.采用酚/氯仿去除蛋白的效果较单独使用酚或氯仿好。一般来讲,要将蛋白质尽量除干净,需多次抽提,本实验虽只抽提一次,已能达到实验要求。注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相混于其中。4.乙醇沉淀质粒DNA是最常用的沉淀方法,通常采用冷乙醇(

10、无水乙醇贮于-20),沉淀条件为-20、1h。因本实验为微量快速,室温下数分钟DNA即可沉淀,虽然DNA量少,但纯度相对高(因为低温长时间杂质也一并沉淀下来),有利于以后的酶切及电泳结果。沉淀方法也可用异丙醇,只需0.54倍体积常温下即可将DNA完全沉淀出来,这对于大体积的质粒DNA沉淀十分有效。但缺点是常将盐等亦同时沉淀出来,因此需要用70%乙醇很好地洗涤。一般来讲广泛应用的沉淀试剂还是乙醇。实验三 DNA的限制性内切酶解及电泳（参考酶使用说明书）一、实验原理DNA的限制性内切酶酶切技术是分子克隆和基因操作中最为基本和重要的方法之一。限制性核酸内切酶,简称限制性内切酶、限制酶或内切酶,是一类

11、能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,主要存在于原核细胞中。限制性内切酶有I、三类, 其中第II类酶在分子克隆和基因操作中最为有用,是常用的分子生物学工具酶,其基本特性如下:专一性地识别并切割特定的核苷酸序列,例如:EcoRI酶的识别与切割序列为:5'GAATTC3'3'CTTAAG5'2.识别的核苷酸数目多为46bp长度范围,少数酶能识别更长的碱基序列,如813bp。3.识别序列大多数为二重对称,或称为回文序列。少数酶酶切后产生带平末端的DNA片段,如HpaII、Alu I和PvuII等,但大多数酶切割产生的片段具有凸出的粘性末端,如EcoRI酶

12、切后产生5F-P粘性末端,而PstI则产生3'-OH粘性末端。4.有的不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列,甚至切割位点也相同,这些酶称为同裂酶或异源同工酶,例如HpaII和MspI。有的限制性内切酶识别位点不同,但对DNA切割后能产生相同的粘性末端,这些酶称为同尾酶,如BamHI、BglII、MboI、XhoII等。5.限制性内切酶一般都以镁离子为唯一的辅助因子,并要求有一定的盐离子浓度、酸碱度和温度条件。限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同,可采用单酶切、双酶切

13、和部分酶切等不同的方法。根据酶切反应的体积不同,又可分为小量酶切反应和大量酶切反应等。一般情况下,小量酶切反应用于质粒等的酶切鉴定,体积为20L,大量酶切反应用于制备目的基因片段,体积为50100L。本实验安排的是EcoRI对质粒DNA的小量酶切、Hind和SalI对质粒DNA的双酶切以及Sau3AI对真核细胞基因组DNA的部分酶切。二 仪器、材料与试剂(一) 仪器高速离心机,冷冻离心机,水浴锅,稳压电泳仪,电泳槽,手提式紫外检测仪,紫外检测仪,EP管,吸嘴,微量进样器,烧杯,量筒,塑料手套,慑子,剪刀,三角瓶。(二)试剂(1)EcoRI 限制性内切酶(附10×酶切缓冲液)。(2)H

14、indIII 限制性内切酶(附10×酶切缓冲液)。(3)NruI 限制性内切酶(附10×酶切缓冲液)。(4)Sau 3AI限制性内切酶(附10×酶切缓冲液)。(5)DNA的HindIII酶切样品,作为相对分子质量标准。(6)无菌水:量取50mL重蒸水于100mL三角瓶中,1.034×105Pa灭菌20mino分装于几只灭菌过的EP管中,贮存-20备用。(7)0.2%溴酚蓝、50%蔗糖上样缓冲液。(8)1mg/mL溴化乙锭溶液。(9)电泳缓冲液。(10)琼脂糖。(三)材料纯化的PCMV-M 质粒DNA。三 实验步骤(参考酶使用说明书)(一) PCMV-M

15、质粒DNA的EcoRI小量酶解1.在无菌Ep管中用微量进样器依次加入下列试剂无菌水7LEcoRI10×缓冲液2LPBR322质粒DNA10L(含0.21gDNA)EcoRI限制性内切酶1L(5U/L)总体积20.L2.离心2s,收集并混匀反应液。3.37水浴1.52h。4.取出Ep管,吸取12L进行电泳分析,以DNA HindIII酶切标准相对分子质量为对照，电泳鉴定DNA酶解效果。如酶解不完全,可继续37水浴,或加入适量限制性内切酶后继续反应。5.经电泳观察酶切反应完全后,将上述反应液置65水浴中1015min,中止酶切反应,保存于一20备用。(二)HindIII和Sal I对pB

16、R322质粒DNA的双酶切1.在无菌Ep管中周微量进样器依次加入下列试剂无菌水15LHindIII 10×缓冲液2L质粒DNA2L(含12gDNA)HindIII限制性内切酶1L(5U/L)总体积20L2.离心2s,收集并混匀反应液。37水浴1h。3.加入1L1molANaCl,稍加混匀后再加入1L&门限制性内切酶.4.离心2s,收集并混匀反应液。37水浴1h.5.以DNA HindIII酶切标准相对分子质量为对照,电泳分析鉴定DNA酶解效果。(三)限制性内切酶的部分酶解1.在0.5mLEP管中,建立以下混合体系进行基因组DNA酶解:10×Sau3AI缓冲液 5L提

17、取的基因组DNA20L(2560g)无菌重蒸水75L总计100L2.将上述混合物于55水浴15min,充分分散基因组DNA片段。3.将反应混合物分装于5支Ep管中,其中管1为30L,管2管4各为20L,管5为10L。冰浴放置。4.按310U/gDNA的量加入Su3AI于管1,轻弹管壁混匀,短暂离心2S收集反应物,冰上放置。5.从管1中吸取10L反应物转至管2,迅速混匀后,冰上放置。6.依次从管2吸取10L反应物至管3,管3至管4,管4至管5,连续稀释后,各管体积均为20L。7.37保温20min,68水浴58min,使Sau 3AI内切酶失活,置于冰上.8.从每管20L酶解产物中各取4L在0.

18、5%琼脂糖凝胶中电泳,低电压下缓慢电泳516h,判断不同酶解产物的大小范围.四 实验安排本实验仅需半天到一天。五、讨论1.实验安排:本实验仅需半天到一天,安排单酶切反应和部分酶切反应时,同时进行双酶切反应中第一种酶的消化。第一种酶反应结束后,补充适当的NaC1,再加入第二种酶进行反应,此后可进行单酶切和部分酶切反应的电泳鉴定,直至双酶切反应完全。也可仅安排单酶切反应或双酶切反应。部分酶切实验放到基因组DNA文库构建时进行。2.对于双酶切反应,如果两种限制性内切酶反应条件相同或相似,可以同时加入两种酶进行酶切,但反应体积应稍大些,以免保存酶的甘油浓度过高,影响酶的活性;如果酶的反应条件相差较大,

19、一般先进行第一种酶的酶切反应,消化结束后采用乙醇沉淀法,回收线性化的DNA,再建立第二种酶的酶解反应体系,继续酶切。如果两个酶的反应条件只是温度上的差别,可以先加一种酶进行酶解,然后加入另一种酶在相应的温度条件下反应。如果两个酶的缓冲液中盐浓度相差较大,也可如本实验一样,先进行低离子浓度酶的酶解反应,待酶解完全后,补加氯化纳及相差的化学成分或调节pH值,再加入第二种酶继续酶解或先进行较小体积的酶切反应,然后再用第二种酶要求的缓冲液稀释后进行第二种酶的反应。3.酶切时加样顺序一般为水、缓冲液、DNA及酶液。其中水的体积可变,由反应体系中其余各成分定量后确定。吸取酶液时,要在冰浴上操作并从溶液表明

20、吸取,以防止吸嘴沾去过多的酶液,取液后盖紧盖子,立即放回-20冰箱,防止限制性内切酶的失活。4.限制性内切酶一般保存在50%甘油的缓冲液中。当酶切反应混合物中甘油的含量超过5%,将会抑制酶的活性或产生酶的星号活力,因此酶的用量体积一般不超过反应总体积的10%。5.DNA的质量是影响酶切效果的因素之一。DNA中包括DNase在内的蛋白杂酶等会使DNA降解,并且随着酶切时间的增长,降解越严重。杂质DNA或RNA会与酶发生非专一性的结合而使酶活相对减少,甚至会导致切不动目的DNA片段。样品中酚、氯仿、乙醇和EDTA等有机或无机溶剂则能抑制酶的活性,量大时甚至使酶失活,因此DNA样品的质量要有所保证。

21、实验四 PCR基因扩增及电泳1985年,美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段,但该酶不耐热。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶,将此酶命名为TaqDNA多聚酶(Taq DNA polymerase

22、)。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化,继而PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪,使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年获得诺贝尔奖。而PCR技术也成为生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。一 实验原理多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是20世纪80年代发展起来的一种体外酶促扩增特定DNA片段的技术，由高温变性、低温退火和适温延伸等3步反应组成一个周期，多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其基本原理类似于DNA的天然复制过程：单链DNA模板在一小段互补聚核苷酸引物引导下，利用DNA聚合酶的酶促反应按

23、53方向复制出互补DNA。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。1.变性:加热使模板DNA在高温下(94)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。2.退火:使溶液温度降至5060,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段。3.延伸:溶液反应温度升至72,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5'3'方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环, 从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的

24、链又可成为新一轮循环的模板,经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。PCR能快速灵敏特异地扩增目的基因或DNA片段，成为分子生物学和基因工程的有效手段，可用于基因的分离克隆核苷酸序列分析基因表达调控的研究遗传病和传染病的诊断致病机制的探索和法医鉴定等诸多方面。典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgC12、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合酶。二 仪器、材料与试剂(一)仪器1.PCR热循环仪 2.琼脂糖凝胶电泳系统（二)材料1.DNA模板2.4种dNTP3.引物1、引物24.Taq酶5.琼脂糖6.DNA相对分子质量标准物7.吸头、80.2mlPCR管

25、(三)试剂1. 10×缓冲液500mmol/LKCl100mmol/LTris-HCl(pH8.3,室温)15mmol/LMgC120.1% 明胶2. 4×dNTP1mmol/L dATP1mmol/L dCTP1mmol/L dGTP1mmol/L dTTP3. Tag酶 1U/L4. DNA模板 lng/mL5. 引物1 引物2 （引物溶液浓度 10pmo1/L）三 实验步骤1. 在0.5mLEppendorf管内配制25L反应体系反应物 体积/LddH20 1110×PCR缓冲液 2.52.5mmol/LdNTP 2.025mmol/LMgC12 1.5引物

26、1 1.0引物2 1.0模板DNA 5Tag酶 1混匀,加25L石蜡油。2.按下述程序进行扩增94预变性 2 min94变性 45sec57退火 1min72延伸 45sec重复步骤30次:72延伸 3min4 保存3.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 配制1%琼脂糖凝胶,取8L扩增产物电泳。保持电流4OmA。电泳结束后,用EB染色15min,紫外灯下观察结果。四 实验安排 本实验1天内可完成，上午做PCR反应，下午做电泳检测五 讨论1.假阴性,不出现扩增条带PCR反应的关键环节有:模板核酸的制备;引物的质量与特异性;酶的质量;PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板:模板中含有

27、Taq酶抑制剂;在提取制备模板时丢失过多,或吸人盼;模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,有可能是模板核酸提取过程出了毛病,可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一

28、致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏,导致引物变质降解失效。引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度: Mg2+千浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20L、30L、50L或100L,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20L后,再做

29、大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。2.假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源

30、性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列O靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压灭菌O所用离心管及进样吸头等均应一次性使用O必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性,可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PC

31、R方法来减轻或消除。3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体;二是与Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引物;减低酶量或调换另一来源的酶;降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数;适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性,65左右退火与延伸)。4.出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂

32、抹带或片状带或地毯样带,其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高, Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另一来源的酶;减少dNTP的浓度;适当降低Mg2+浓度;增加模实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化带有外源DNA片段的重组体分子在体外构建之后,需要导人适当的宿主细胞进行繁殖,才能够获得大量的单一的重组体DNA分子。将外源DNA分子导入受体细胞的途径,包括转化(或转染)、转导、显微注射和电击穿孔等多种不同的方式。转化和转导主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞,而显微注射和电击穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。在基因操作

33、中,转化一词严格地说,是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的过程,而转染一词则是专指感受态的大肠杆菌捕获和表达噬菌体DNA分子的过程。但二者从本质上讲没有什么根本的区别,无论是转化还是转染,其关键的因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞,以提高膜的通透性,从而使外源DNA分子能够容易进入细胞内部。所以习惯上,人们往往也通称转染为广义的转化。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株(常用R-、M-表示)。受体细胞经过一些特殊的方法处理后,细胞膜的通透性发生变化,为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。在一定条件下,将带有外源DNA分子

34、的重组体与感受态细胞混合保温,使DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制和表达,实现遗传信息的转移,从而使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体,即带有异源DNA分子的受体细胞。通过本实验的学习,加深理解转化在分子生物学研究中的意义和应用,并掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞、外源质粒DNA分子进入受体菌细胞并筛选转化体等方法。一、实验原理用物理或化学的方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。本实验以大肠杆菌(Escherichia)DH5菌株为受体细胞,用CaCl2试剂处理受体菌,当细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理后,细菌细胞在0和低渗

35、状态下,膨胀成球形,然后与质粒pIIC19DNA混合,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42短暂热冲击处理后,促进细胞吸收DNA复合物。当加入适宜培养基恢复细胞特性并在平板上培养生长数小时后,细胞分裂增殖,被转化的细菌中,重组子基因得到表达。pUC19质粒携带有抗氨苄青霉素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性,用AmpR表示。这样在含有氨苄青霉素的选择性培养基平板上,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。转化体经过扩增培养后,可将转入的外源DNA分子分离提取出来,进行电泳、电镜观察,并制作限制性内切

36、酶切割图谱、分子杂交及DNA测序等分子生物学实验。二 仪器、材料与试剂(一) 仪器1.超净工作台2.低温离心机3.恒温摇床4.恒温箱5.-70冰箱6.恒温水浴器(二)材料1.氯化钙(CaCL2)2.膜蛋白胨3.酵母提取物4.氯化钠(NaCL)5.氨苄青霉素6.大肠杆菌DH57.pQE30质粒8.50mL离心管9.吸头、小指管10.试管、培养血、锥形瓶等(三)试剂1.0.1mol/LCaCL溶液2.LB液体培养基配制每升培养基,应在950mL去离子水中加入:膜蛋白胨(bactoptone) 10g酵母提取物(bacto-yeastextract) 5gNaCL l0g摇动容器直至溶质完全溶解,用NaoH调节pH至7.0,加入去离子水至总