农科院2015高级生物化学复习题汇总最终打印版

1、2015年高级生化复习题五组汇总2015年高级生化蛋白质复习题（感谢蛋白组同学：李战、李超、窦心敬、王宇洲、张晓慧、姚全杰、王杰、安怡昕、郭润婷、顾源、侯含的共同努力，感谢大家！）蛋白质的定义：一种由DNA编码的L型氨基酸通过碳原子上的氨基和羧基间形成酰胺键，连接而成肽链，经翻译后加工形成具有特定空间构象和生物功能的生物大分子。1. 蛋白质有哪些主要功能？Ø 催化作用：酶Ø 结构、机械支持：纤维蛋白原、微管蛋白等细胞骨架组成蛋白Ø 运输（及跨膜运输）：血红蛋白，离子通道蛋白Ø 免疫保护：抗体、凝血酶、毒蛋白（蛇、蜂毒）Ø 生长和分化的控制：胰岛

2、素、正/负调控因子、阻遏蛋白Ø 神经冲动的产生和传递：突触后膜受体蛋白Ø 信号转导Ø 电子传递：铁氧还蛋白、电子传递蛋白Ø 贮存功能：铁蛋白、肌红蛋白Ø 其他：甜蛋白，节肢弹性蛋白2. 蛋白质的分类(1) 按组成分类Ø 简单蛋白质：仅由氨基酸组成的蛋白质根据其溶解性又可分为7类清蛋白albumin球蛋白globulin醇溶(谷)蛋白prolamine谷蛋白glutelin精蛋白protamine组蛋白histone硬蛋白scleroproteinØ 结合蛋白质：由氨基酸和非蛋白质组分，以共价结合或非共价形式结合的蛋白质根据其

3、结合的非蛋白质组分又可分为8类糖蛋白(glycoprotein)：含糖量<4%粘蛋白(mucoprotein)：结合氨基多糖核蛋白(nucleoprotein)脂蛋白(lipoprotein)：磷蛋白(phosphprotein)金属蛋白(metalloprotein)血红素蛋白(hemoprotein)黄素蛋白(flavoprotein)(2) 按分子形状和溶解性分类球状蛋白质globular proteins分子接近球状或椭球状，多肽链折叠紧密，溶解度较好，能结晶。纤维状蛋白质fibrous proteins分子很不对称，通常为规则线性或片层结构。胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝心蛋白

4、通常不溶于水或稀盐溶液膜蛋白质membrane proteins与细胞的各种膜系统结合而存在，以其疏水残基与膜的烃链相互作用(3) 按功能分类活性蛋白质active protein在生命运动过程中一切有活性的蛋白质以及他们的前体。酶激素蛋白运输与贮存蛋白质非活性蛋白质passive protein主要包括一大类担任生物的保护或持作用的蛋白质。胶原蛋白弹性蛋白丝心蛋白(4) 按二级结构单元排列方式分类全域a全域b交替的/a非交替+a不规则小蛋白(富含二硫键或配体)3. 按二级结构单元排列方式对球形蛋白(或结构域)划分的五种类型：全域a：例如珠蛋白型螺旋全域b：1. 反平行型结构:木瓜蛋白酶2.

5、“希腊钥匙”反平行桶：刀豆素3. 平行螺旋：抗冻蛋白交替的/a：/a相间型蛋白：细胞色素C非交替+a：/a分离型蛋白：绿色荧光蛋白不规则小蛋白(富含二硫键或配体)1. 富含二硫键的蛋白：胰岛素等2. 富含金属离子的蛋白：铁氧化还原蛋白4. 蛋白质一级结构的比较通常所指的蛋白质一级结构是指这些成熟蛋白质的氨基酸残基序列。1) 不同种属来源的同一蛋白质比较u 揭示生物进化的信息亲缘关系相近的种属中，同源蛋白的一级结构有更大的相同性。例如：细胞色素C(cyt c)存在于全部具有线粒体呼吸链的生物体中细胞色素C的三维结构在进化过程中守恒一级结构与高级结构的辨证关系一级结构决定高级结构，高级结构选择一级

6、结构。同源蛋白质的氨基酸序列分析揭示血红蛋白、肌红蛋白有着一个共同的进化祖先珠蛋白。2) 功能相似的蛋白质比较u 确定蛋白质一级结构上的同源性和保守区功能越相近的蛋白质，结构上的同源性越高。（与功能相关联的氨基酸残基序列也常称为motif），根据“近亲”蛋白质的motif类型，可划分蛋白质家族。例如：丝氨酸蛋白酶:Ø本家族成员与底物的结合部位各不相同，但共有水解蛋白质的催化活性。均含有与催化活性相关的由Ser-Asp-His组成的电荷中继系统。3) 功能相差较远的蛋白质一级结构比较u 建立蛋白质超家族(superfamily)u 发现蛋白质含有的新motif或结构域，并揭示可能的新功

7、能。例如：1.肺泡表面活性物质A的脱辅基蛋白(PSA)：1985年，测定了PSA的氨基酸顺序1986年，测定了肝细胞表面半乳糖结合蛋白的一级结构，发现二者有很大一段肽段高度同源(半乳糖结合蛋白的糖识别域，CRD)，证明了PSA是糖结合蛋白。2.建立了C类动物凝集素超家族5.蛋白质的二级结构的类型有哪些？蛋白质的额二级结构是指多肽链主链骨架（不含R侧链）中的各个肽断所形成的规则或者无规则的空间构象；更是完整肽链结构（三级结构）的结构单元（即构象单元）二级结构类型主要有：螺旋结构（-螺旋和-螺旋）、-折叠、回折、-发夹和环、无规卷曲。螺旋结构：a. -螺旋(3.613-螺旋，非整数螺旋)第n个氨基

8、酸的C=O与n+4个氨基酸的N-H（NH基团）形成H键。3.6个氨基酸残基/圈，上升0.54nm/圈螺。C原子相邻的两个二面角都是恒定值，所有肽键都呈反式。肽链中氨基酸残基的R侧链分布在螺旋的外侧。-螺旋是一个偶极矩；末端是极性的，并且总是处于蛋白质表面。天然蛋白质的-螺旋几乎都以右手螺旋为主。非典型的-螺旋：N-HO不在一条直线上，不能形成第二圈螺旋往往在-螺旋末端形成。影响-螺旋形成的因素：在多肽链中连续出现带同种电荷的极性氨基酸，使螺旋不稳定；在多肽链中只要出现Pro，-螺旋就被中断，产生一个弯曲或结节；Gly的R基团太小，难形成-螺旋所需的两面角，故也能破坏-螺旋；b. 310-螺旋第

9、n个残基的羰基C=O与第n+3个残基-NH形成氢键。c. -螺旋(4.416-螺旋，非整数螺旋)第n个残基的羰基C=O与第n+5个残基-NH形成氢键，氢键闭环16个原子。-折叠：a.-折叠股每股-sheet strand的平均长度约20Å(2nm)，相当于6.5个氨基酸残基，通常3-10个氨基酸残基。单股-sheet strand是不稳定的。多股(2 or 2以上)的-sheet strand之间通过氢键联接可形成稳定的片层结构-折叠片。b.-折叠片或-片层结构肽链按层排列，由相邻肽链形成有规则的氢键维持结构的稳定性；相邻肽链走向可以是平行或反平行的；肽链中氨基酸残基的R分布于片层的

10、上下；大多数蛋白质的-折叠片都是非平面的。它们向右手方向扭曲，变成右手扭曲片层。c.-突起：折叠股中额外插入的一个残基或有一折叠股中的一个残基没有参与和相邻-折叠股间的氢键形成。回折:多肽链中，经常出现的180转弯的结构。转角是最短的连接，也是最短的紧密环。a. -转角由4个氨基酸残基构成的环状结构，第n个氨基酸的C=O与n+3个氨基酸的N-H形成H键。多存在蛋白质分子表面，多由亲水氨基酸残基组成。b.-转角由3个氨基酸组成，含有2个H键，180°转角。-发夹和环a. -发夹由一条伸展的多肽链弯曲形而成的两条等长、彼此相邻、反向平行的肽段构成；两条肽段靠氢键联系，氢键有1-6个；此构

11、象包含10-11个氨基酸残基b. 环可以看成是转角的延伸，最常见的是由68或616个残基组成的肽段。无规卷曲有一些局部结构的肽段(约10%)，相对于规则或部分规则的二级结构是无规则的,其结构具有更大的任意性。大多构成蛋白质和酶的活性中心。6.什么是拉氏构象图？蛋白质主链中有3类不同的二面角，分别为：、。侧链的二面角称为1、2等，确定非键合原子间的最小接触距离，以作横坐标，作纵坐标作图，将允许区、部分允许区、不允许区标注在图中即可得到拉氏构象图。允许区：区域内成对的二面角所决定的主链构象是允许的。非键合原子之间的距离最小接触距离。部分允许区(临界限制区)：成对的二面角所决定的主链骨架构象是不完全

12、允许的。此构象中非键合原子间的距离小于最小接触距离，但大于极限值(比最小接触距离小0.01-0.02nm)。完全不允许区：成对二面角所决定的主链骨架的构象是完全不允许的，非键合原子间的距离小于极限值。拉氏构象图的应用：对主链构象研究起到的作用；可用于判断检查所得到的蛋白质结构模型的正误。7. 角蛋白的结构特点Ø 仅有螺旋(二级结构)的简单重复；Ø 原纤丝内含多个二聚体结构，二聚体结构的中央是由两个右手螺旋的多肽链复绕成左手超螺旋棒状结构；Ø 含大量疏水残基；Ø 链间由二硫键连接，一般认为每4个螺圈就有一个交联键，Cys含量较高(Cys>18%)，根

13、据含硫量可分为：硬角蛋白和软角蛋白。Ø 性质：有很好的伸缩性能。8.丝心蛋白的结构特点【选择性回答】Ø 天然的角蛋白除丝心蛋白外（丝心蛋白属于角蛋白），大多数鸟类和爬行动物的羽毛、皮肤、爪、啄和鳞片中均含角蛋白。角蛋白充分伸展后可逆地转变为角蛋白。Ø 丝心蛋白由反平行折叠片以平行的方式堆积成多层结构；Ø 折叠构象中含约50个重复单位：(Gly-Ala)2-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Gly-(Ser-Gly-Ala-GlyAla-Gly)8-Tyr-Ø Gly位于折叠片平面的一侧，Ser和Ala等都在平面的另一侧；Ø 链间

14、主要以氢键连接，层间主要靠范德华作用维系；Ø 具有很高的抗张强度具有柔软的特性不能拉伸的性质9.胶原蛋白的原胶原分子的结构特点原胶原分子是胶原蛋白的基本结构单位每个原胶原分子由三条链（-肽链）组成的三股螺旋结构（右手超螺旋），每条链为左手螺旋；每条链约含1000个氨基酸残基，链一级结构96%遵守(Gly-X-Y)n，X多为Pro；Y多为Hyp或Hly三股螺旋链间靠H-键和范得华作用维系，胶原纤维可以通过分子内和分子间的交联得到进一步增强和稳定。分子内交联N-末端区(非螺旋区)内赖氨酸残基之间进行的。原胶原分子间形成的空穴区作为糖结合部位，可能在骨骼形成中起作用。10.什么是两可肽？蛋

15、白质多肽链中的某一肽段在不同条件下存在可能形成-螺旋和-折叠两种不同形式二级结构，这样的肽段被称为两可肽。另附【可不答】：举例：五肽段：VAHAL(Val-Ala-His-Ala-Leu)丙糖磷酸异构酶：螺旋；灰色链霉菌蛋白水解酶A：折叠五肽段：VNTFV(Val-Asn-Thr-Phe-Val)无脊椎血红蛋白：螺旋；核糖核酸酶：折叠可能的影响因素：邻近残基的二级结构倾向；肽链中远程肽段的影响；肽段是处于分子表面还是被包埋在分子内部。11.影响蛋白质二级结构改变的因素Ø 蛋白质二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的，氢键是稳定二级结构的主要作用力。如果对氢键进行破坏

16、，就可以影响蛋白质的二级结构。其中，酸碱度，温度，溶剂还有极端变形条件都有可能改变蛋白质二级结构。Ø pH能影响氨基酸的带电荷性，如多聚赖氨酸在pH7不形成螺旋，因为在此pH下Lys的R基带正电荷，静电排斥，不能形成内氢键，而在pH11时自发形成螺旋。Ø 非极端的温度变化也可以改变蛋白质的二级结构，比如多聚赖氨酸在pH=11.8时，4构象为螺旋，而在52时，变为折叠。Ø 特殊的溶剂可以改变蛋白溶液中的二级结构，比如水溶液中的伴刀豆球蛋白A的螺旋量为2%，但是在70%的氯乙醇溶液中，螺旋含量可以升高到55%。再比如水溶液中的弹性蛋白酶的螺旋量为7%，但是在十二烷基硫

17、酸钠溶液中，螺旋含量可以升高到35%。Ø 强酸、强碱可以使蛋白质变性，是因为强酸、强碱可以使蛋白质中的氢键断裂。也可以和游离的氨基或羧基形成盐，在变化过程中也有化学键的断裂和生成，因此，可以看作是一个化学变化。同时极端的高温也可以断裂氢键，甚至影响三级结构。12.多肽链主链的空间限制是哪两个方面Ø 一、肽键的部分双键性质：肽键C、O、N原子间共振相互作用，使得肽键虽是单键却有部分双键性质，不能够自由旋转。同时，六个原子被束缚在同一平面上，形成了刚性的肽平面（两个碳在对角位置，肽键呈反式构型）。Ø 二、肽平面与碳原子的二面角和：两相邻肽平面之间，能以共同的碳为定点旋

18、转，绕碳-N键旋转角度是角，碳与C旋转角为角。和称为二面角，也是构象角。二面角所决定的构象是否存在，主要取决于两个相邻肽单位中，非键合原子之间的接近有无阻碍。由拉氏构想图得知，同时等于0°时的构象实际上并不能存在，因为两个相邻平面上的酰胺基H原子和羰基O原子的接触距离比其范德华半径之和小，因此将发生空间重叠。这样的构象是立体化学所不允许的。180和0不允许，因为两个羰基氧原子接触距离最小，斥力最大。0和180不允许，因为两个亚氨基氢原子接触距离最小，斥力最大。Ø 综上，上诉两个因素使得能够存在于蛋白质中的主链构象大大减少，从而对空间构想进行限制。13.形成蛋白质结构域的意义

19、（1）各个结构域分别折叠，其动力学上更有利；（2）结构域自身紧密装配，结构域之间的柔性连接使每个结构域间可以较大幅度的相对运动；（3）多个结构域形成的间隙部位往往是蛋白质的功能部位，结构域的相互作用有利于蛋白质分子产生别构效应。14.蛋白质三级结构折叠的规律主要有哪些？蛋白质的基本单位为氨基酸，而蛋白质的一级结构指的就是其氨基酸序列，蛋白质会由所含氨基酸残基的亲水性、疏水性、带正电、带负电等特性通过残基间的相互作用而折叠成一立体的三级结构。（1）蛋白质三级结构折叠信息来自一级结构；（2）在体外，折叠可以是自发的；（3）在给定环境条件下，总是采取低自由能的构像状态；（4）多肽键的折叠具有手性效应

20、；（5）折叠倾向于疏水侧键在分子内部，亲水侧键分布于分子表面。15.什么是二硫键异构酶PDI和肽基脯氨酰异构酶PPI?PDI：protein disulfide isomerase，是内质网中一种重要的折叠催化剂，催化蛋白质形成正确配对的二硫键（氧化活性）,在加速新生肽链折叠中间体二硫键的改组中起重要作用（或催化错误配对二硫键的重排），并具有分子伴侣活性。（课件答案在1-2 p38）PPI：peptidyl prolyl cis-trans isomerse，也叫肽基脯氨酰顺反异构酶。不含Pro残基的蛋白质，反式的氨基酸亚氨基的肽键是更稳定的，顺式构象所占比例极少，新合成的多肽链中，脯氨酸氨基

21、酸端形成的肽键（Xaa-Pro）基本都是反式的；而在球形蛋白质（含pro残基的蛋白质）中大约10%Xaa-Pro肽基是顺式的，催化Xaa-Pro肽键顺反式构象改变的酶就是肽基脯氨酰异构酶。（课件答案在1-2 p40）16. 蛋白质溶液的浓缩方法及原理（课件答案在2-2 p32网上更为详细答案链接超滤法：基本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质等被滤膜阻流。将蛋白质样品装入适当的超滤管中，经一定时间离心，溶剂穿过超滤管滤膜流出而使蛋白质溶液得以浓缩。盐析法：硫酸铵盐析法

22、最为常用。高浓度的盐粒子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，使溶液中自由水分子数减小，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解浓度，使之从溶液中沉淀出来，即使蛋白质在高浓度中性盐中析出而浓缩的过程。透析袋浓缩法：是在透析技术的基础上改良而来，即将透析液换成可以吸水的溶液或固体吸附剂，从而达到浓缩蛋白质的效果。将蛋白质样品封闭在透析袋中，再将透析袋包埋于甘油、聚乙二醇8000等试剂之中，放置于4，透析袋中溶剂将被吸出而达到浓缩的效果。有机试剂沉淀法（如丙酮、乙醇、甲醇等）：有机溶剂加入水中可使溶剂的介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力，从而破坏蛋白质的水化层及表面电荷而使蛋白质沉淀。非离子多聚物沉

23、淀法：最常用的多聚物是聚乙二醇，有两种方法，1）选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。此方法基于不同生物分子表面结构不同，有不同分配系数。并外加离子强度、PH值和温度等影响，从而扩大分离效果。2）选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。该方法操作时先离心除去大悬浮颗粒，调整溶液PH值和温度至适度，然后加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷贮一段时间，即形成沉淀。冷冻干燥法：将待干燥物在低温下快速冻结后，在高真空条件下将其中的冰升华为水蒸气，除去冰晶，待升华结束后再进行解析干燥，除去部分结合水的的干燥方法，最终达到浓缩蛋白质的目

24、的。17.凝胶过滤柱层析的原理及测定蛋白质分子量的原理凝胶过滤柱层析的原理：凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，大部分为一些交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了测定蛋白质分子量的原理：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积v，该体积v与相应蛋白质分子量的自然对数成反比，以此

25、做曲线，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。18.离子交换柱层析的原理离子交换柱层析的原理：该方法是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的目的；填料在一定PH、盐浓度的下带电荷，低盐上样的蛋白质溶液，与填料带相反电荷的蛋白质可以结合到中柱上，杂蛋白随流动相穿柱而过，使蛋白质得到一定的分离。提高洗脱液的盐浓度或改变pH值，由于蛋白质所带的相反电荷不同，与填料有不同的结合能力，则在不同的盐浓度或不同的pH值下被洗脱下来，达到进一步分

26、离的目的。离子交换层析分为阳离子离子交换柱和阴离子离子交换柱。当蛋白质溶液的pH高于pI时，蛋白质带负电荷，可结合到阴离子离子交换柱上（填料带正电荷）。19.固定化金属螯合亲和层析纯化His-tagged蛋白质的原理Ø 固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面暴露一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离的一项技术，它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。Ø （作用原理：固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子

27、能够与电子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在溶液中会被水分子或阴离子占据。然而，当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时，氨基酸残基的供电原子就会与金属离子结合形成复合物，取代原先结合的水分子或阴离子，这样就能使蛋白质分子结合在固体表面。能与螯合反应的基团很多，例如氨基酸中的氨基和羧基，以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子，但是，由于蛋白质表面的氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而具体使用时根据金属配基的亲和力大小不同，选择不同的金属配基加以分离纯化）Ø 特别适合分离纯化变性蛋白，尤其是带6个组氨酸标签的重组蛋

28、白，这种蛋白质对金属离子有很高的结合力，在分离纯化后再用化学法或酶法将标签切掉，从而得到目标蛋白。过程大致为：（1）His-tagged蛋白质通常在N端或者C端带有6个His蛋白标签，这些His蛋白能专一性地结合在螯合有Ni2+（或Zn2+或Co2+）亲和柱上，杂合蛋白则通过亲和柱而与His-tagged蛋白质分离；（2）增大洗脱液中的咪唑浓度。高浓度咪唑与His-tagged蛋白质竞争结合柱中的Ni2+，从而将His-tagged蛋白质洗脱下来。20.蛋白质免疫印迹western-blot的原理蛋白质免疫印迹（Western blotting or immunoblotting）：利用抗原抗

29、体的特异性反应在蛋白质混合液中定性及半定量检测某种蛋白质的方法。一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。蛋白质混合液先经SDS-PAGE凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带；把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物（如硝酸纤维素膜即NC膜、PVDF膜）即为印迹过程；再用蛋白溶液（如10的BSA）处理以封闭膜上剩余的疏水结合位点，最后在膜上进行抗原抗体特异性反应：用所要研究的蛋白质的一抗处理，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗；处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，处理后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置，这样

30、就可以利用二抗上所带的标记来鉴定、检测目的蛋白。21.SDS-PAGE（双向电泳分离蛋白质）的原理及其实际应用蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing,IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。蛋白质双向电泳是将蛋白质等电点和分子量两种特性结合起来进行蛋白质分离并用考马斯亮蓝染色获得蛋白质的电泳分离图谱的技术，具有较高的分辨率和灵敏度，已成为蛋白质特别是复杂体系中的蛋白质检测和分析的一种强有力的生化手段。SDS-P

31、AGE因易于操作，而具有广泛的用途，是许多研究领域的重要的分析技术。其主要应用有：蛋白质纯度分析蛋白质分析量的测定，根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量蛋白质浓度的测定蛋白质水解的分析免疫沉淀蛋白的鉴定免疫印迹的第一步蛋白质修饰的鉴定分离和浓缩用于产生抗体的抗原分离放射性标记的蛋白质显示小分子多肽22.测定蛋白质三维结构时，X-射线晶体衍射技术与NMR技术各有哪些优点和局限？1)NMR优势：可测定溶液中的蛋白质构象，无需蛋白质结晶不破坏蛋白质分子构象能测定蛋白质分子构象的变化过程能研究蛋白质分子间的以及蛋白质与其他配体之间的相互作用NMR不足：很多时候达不到X-射线晶体衍射技术的精度能测定的蛋

32、白质的分子量相对较小2)X-射线晶体衍射技术优势：方法成熟，适用于能长出较好单晶的蛋白质分辨率高，可高通量化X-射线蛋白质晶体衍射技术不足：需要培养对称性好的、适于衍射的蛋白质单晶，该步骤是蛋白质晶体衍射技术的瓶颈需要解决相位问题23.气象扩散法培养蛋白质晶体的原理：（比较详细，选择性回答）u 首先：蛋白质晶体结构分析的分析就是需要进行晶体培养，晶体培养：获得适用的单晶(关键步骤)结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率。u 其次：晶体必须满足的两个条件：1.单晶，足够大(大于0.1mm3)；2.结晶过程，形成晶核晶核长大u 影响晶体生长的因素样品纯度：包括均匀性，样品最好是新制备的；浓度

33、：控制适宜的过饱和度，形成少量晶核；pH：长出不同晶型的晶体；温度：一般温度升高，蛋白质溶解度增大；离子强度：盐析与盐溶；有机添加剂：可降低蛋白质溶解度。u 原理1（老师课件）：在一个封闭体系中，液池内缓冲液中的各种试剂浓度均略高于蛋白质液滴中的浓度(液池内不含蛋白质)，通过体系内蒸汽扩散，溶剂分子从液滴向液池迁移，使液滴内盐浓度增高，蛋白质溶解性降低，达到过饱和而结晶。用气相扩散法进行实验的优点是沉淀剂的浓度梯度可以很方便地进行调节，从而使蛋白质溶液缓慢地形成过饱和溶液，晶体生长的速度得到了很好的控制。u 原理2（网上寻找易于理解）：也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/m

34、l)溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度(1.0 M)的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度(2.0 M)硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的。u 注意事项：1. 硅化处理：载样盖玻片必须硅化，以防止蛋白质样品的扩散延伸。2. 悬滴法：样品用量少，1-5µl，液滴体积不能过大。坐滴法：样品用量大，液滴体积³50µl，可长出大的晶体，重复性好。24.蛋白质翻译后修饰有哪些方式？细胞中几乎所

35、有的蛋白质在从核糖体合成后都有化学上的改变，这些改变可能改变蛋白质的活性、寿命(lifespan)或细胞定位。v 化学修饰乙酰化：最普遍的化学修饰（80%的蛋白），多肽链N-端乙酰化磷酸化：Ser、Thr和Tyr侧链a. 通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。b.大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的。c.至少有30%的蛋白被磷酸化修饰。d.磷酸化的作用位点为蛋白上的Ser,Thr,Tyr残基。f.在磷酸化调节过程中,细胞的形态和功能都发生改变。g.可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程,如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞

36、的增殖、发育和分化等。糖基化：Asn、Ser和Thr侧链a.蛋白质的糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上特定的氨基酸残基共价结合的过程。b.蛋白质糖基化可以按照氨基酸和糖的连接方式分为四类:O位糖基化、N位糖基化、C位甘露糖化以及GPI(糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白)锚定连接。c.蛋白质的糖基化影响蛋白的功能,在许多生物过程中起着重要的作用,如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、细胞与细胞之间的黏附、炎症的产生等。d.很多蛋白,如转录因子、核小孔蛋白、热休克蛋白、RNA聚合酶、致癌基因翻译产物、酶等,都发现了糖基化的翻译后修饰方式。泛素化：Ø在目的蛋白质链内的Lys侧链上加上泛素分子链，接着由蛋

37、白酶体水解a. 泛素由76个氨基酸组成,高度保守,普遍存在于真核细胞内。b. 共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别并降解,这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。c. 与消化道内进行的蛋白质水解不同,整个水解过程需要能量参与。d.泛素标签具有多功能性。比如：导致细胞的紊乱和细胞凋亡细胞器的生物合成新蛋白生成蛋白质输运泛素化还可以影响蛋白质细胞内定位、影响DNA修复及转录调控。膜蛋白末端或其附近加上长的脂链基团a. 脂肪酰锚定蛋白b. 异戊二烯基锚定膜蛋白25.什么是分子伴侣蛋白？P11定义：一组从细菌到人广泛存在的蛋白质，非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合，并帮助它们折叠和转

38、运，通常不参与靶蛋白的生理功能，大都具备ATPase活性，与目的蛋白的结合依赖ATP的水解。分子伴侣是细胞中一大类蛋白质,是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分。分子伴侣的概念有三个特点:凡具有这种功能的蛋白,都称为分子伴侣,尽管是完全不同的蛋白质;作用机理是不清楚的,故用了“介导”二字,以含糊其辞,“帮助”二字可理解为:通过催化的或非催化的方式,加速或减缓组装的过程,传递组装所需要的空间信息,也可能抑制组装过程中不正确的副反应。分子伴侣一定不是最终组装完成的结构的组成部分,但不一定是一个分离的实体。如一些蛋白水解酶的前序列,以及一些核

39、糖核蛋白体的加工前的部分,若具分子伴侣的作用,也称为分子伴侣。组装的涵意比较广,主要指:帮助新生肽的折叠、帮助新生肽成熟为活性蛋白、帮助蛋白质跨膜定位、亚基组装等。26.什么是固有无结构蛋白？P59是指生理条件下缺乏刚性折叠结构，结构松散，肽链呈无规卷曲构象，但却具有明确功能的蛋白质。但这类蛋白不能行使酶等具有刚性结构蛋白质所具有的功能。固有无序化不仅指一种具体的蛋白，也指一种蛋白质中的无序化区域(nativelyunfolded domain,NUD)，其结构是多种动态互变构象的集合。总体而言，此类蛋白质或区域的氨基酸残基组成中亲水氨基酸比例含量升高，疏水氨基酸含量降低。又称为天然无折叠蛋白

40、质(natively unfolded protein,NUP)或固有无序化蛋白(intrinsically disordered protein,IDP)。固有无序化蛋白质结构、功能特点：Ø 是结构松散，肽链以伸展的状态存在Ø 氨基酸组成上总体而言：此类蛋白质中的亲水氨基酸比例含量升高，疏水氨基酸含量降低固有无序化蛋白质/区域的功能Ø 固有无序化蛋白质/区域的功能可能归属于2个方面，但是它们不能行使酶等具有刚性结构蛋白质具有的功能。Ø 固有无序化蛋白质多数是非管家蛋白质，起调控作用，因此：可称为“管家”的“助手”。Ø 固有无序化在分子识别方面

41、重要功能Ø 具有通过调控结构倾向而兼备高特异性与低亲和力的特征，通过改变合适结合位置的结构可与多个分子结合，引导：“一”对“多”的信号传导通路多个不同序列可预知结合，具有结合共同性。2015年高级生化酶学复习题（感谢酶组同学：李正鹏、李小曼、刘晴、张凤、邵莉萍、赵峰、丁庆倩、肖艳青、董荣荣、孙先花、屈亚芳、邱海阳的共同努力，感谢大家！）一、名词解释：1.酶的活性中心（active center）：是酶分子上直接与底物结合，并进行催化作用的部位。2.酶催化作用的专一性：专一性是区分底物分子与底物类似物分子的能力。反应的专一性保证了产物的纯度。3.别构酶:是与代谢调节有关的酶，大多数处于

42、代谢的关键位置。本身的活性也受到严格的调节。是以构想变化影响催化活性的酶。别构酶都是寡聚酶。4.酶的化学本质: 酶是具有催化活性的蛋白质。核酶是具有催化活性的RNA。5.核酶酶活力：核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA序列。核酶又称核酸类酶、酶RNA、 核酶类酶RNA。核酶酶活力指核酶催化一定化学反应的能力。6.酶活力单位：1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1min内转化1mol底物的酶量，或是转化1mol底物的有关基团的酶量。1 IU = 1molmin-17.酶的比活力：酶的比活力Specific activity是指单位重量的蛋白质中所

43、具有酶的活力单位数，反映了酶的纯度。单位：U /mg8.酶的活性中心： 酶的活性中心active center是酶分子上直接与底物结合，并进行催化作用的部位。包括结合部位和催化部位。结合部位：酶与底物结合的部位，决定酶的专一性；催化部位：参加催化的部位，决定酶的催化能力。9.活化能 ：反应物从基态达到过渡态所需的能量10.酶原激活：从酶无活性的前体转变为有活性的酶的过程，这个过程是不可逆的。11.共价催化：酶与底物形成暂时的共价键，稳定了过渡态复合物，降低了反应的活化能，加快反应速度，称为酶的共价催化。包括亲核催化和亲电催化。12邻近效应：由于酶与底物的结合，使分子间的反应成为分子内的反应，有

44、效浓度相对提高的效应。13.定向效应：应物与反应物，酶与反应物间正确取位的效应。14.诱导酶：在细胞中加入特定的诱导物后，诱导产生的酶。15.共价调节酶：能在两种不同的酶的催化下发生可逆共价修饰，使其在有活性形式和无活性形式之间相互转变，从而调节酶活性。磷酸化是可逆共价修饰中最常见的类型。16.核酶(ribozyme)是具有催化活性的RNA， 其化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。 17.米氏常数：(KM ),酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度, 是研究酶促反应动力学最重要的常数18.同工酶：催化的化学反应相同；酶蛋白本身的结构和化学组成不同，亚基组成不同，氨基 酸组

45、成不同，理化性质和免疫性能不同。19.别构效应:调节物与酶的别构中心结合后，引起酶蛋白构象的变化，影响酶的活性中心与底物结合，从而调节酶促反应的速度及代谢过程。二、简答题：1.酶的结构组成：绝大多数酶是蛋白质（1） 具有蛋白质的化学组成；（2） 具有一、二、三、四级结构；（3） 具有蛋白质的各种性质；（4） 具有活性中心。根据结构特点可分为：单体酶：只含一条多肽链。 寡聚酶：含有2条或2条以上的多肽链。 多酶体系：几种酶比此嵌合形成的体系根据酶的化学组成又可分为单成分酶和双成分酶2.诱导契合学说：1）酶与底物在相互作用过程中，底物诱导酶活性中心发生构象变化，2）底物分子中的敏感键产生张力并“变

46、形”。"诱导契合"学说指出，酶并不是事先就以一种与底物互补的形状存在,而是在受到诱导之后才形成互补的形状。底物一旦结合上去,就能诱导酶蛋白的构像发生相应的变化,从而使酶和底物契合而形成酶-底物络合物，并引起底物发生反应。3.酶催化作用的机理：酶能短暂地与反应物结合形成过渡态，从而降低了活化能，从而加速反应。但酶降低反应活化能的关键原因是过渡态稳定作用。4.酶降低反应活化能的原因(一)酶与底物的结合1）、酶与底物的结合有邻近效应与定向效应 邻近效应是由于酶与底物的结合，使分子间的反应成为分子内的反应，有效浓度相对提高的效应。定向反应是反应物与反应物，酶与反应物间正确取位的效应

47、。2）、酶与底物间的弱相互作用是降低反应分子的自由度，帮助底物摆脱水的束缚，诱导酶分子的构象发生变化，补偿底物变形所需的能量。在底物与酶结合的过程中，释放了部分有序的水分子，增加了熵。有利于底物分子与酶分子形成氢键和离子键。3）、酶活性中心的疏水微环境 酶在活性部位内形成一个疏水的微环境，有利于中间产物的生成和稳定。少数极性的或可离子化的氨基酸残基在疏水环境中催化反应。（二）酶对底物的催化1）酸碱催化：质子供体和质子受体间的催化反应。功能基团的解离常数和提供或接受质子的速度是影响酸碱催化的因素。2）共价催化：酶与底物形成暂时的共价键，稳定了过渡态复合物，降低了反应的活化能，加快反应速度，称为酶

48、的共价催化，包括亲核催化和亲电催化。亲核催化是酶分子中具有非共用电子对的亲核基团攻击缺少电子的，具有部分正电性的原子，形成暂时的共价键，稳定了过渡态中间产物。亲电催化是酶蛋白分子中的亲电基团攻击底物分子中富含电子的原子或带部分负电荷的原子，形成共价键，稳定了过渡态中间产物。3）金属离子催化金属激活酶：金属离子与酶结合不紧，金属离子与酶的催化效率有关。金属酶：金属离子与酶结合很紧，金属离子与酶的催化活性有关。（三）酶通常使用几种催化机制综合作用5.酶的分类与命名（一）酶的分类命名包括习惯命名法和国际系统命名法。（1）习惯命名法：1. 一般采用底物而命名：如蛋白水解酶等；对水解酶类，只要底物名称即

49、可，如蔗糖酶、蛋白酶等。2. 依据其催化反应的性质来命名：如水解酶、转氨酶等。3. 结合1、2的命名：如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、磷酸己糖异构酶等（2）国际系统命名法，每种酶都有一个系统名称和习惯名称，分类编号方案如下：1.氧化还原酶类：催化氧化还原反应2.转移酶类：催化功能基团的转移反应3.水解酶类：催化水解反应4.裂合酶类：催化从底物上移去一个基团从而形成双键的反应及逆反应5.异构酶类：催化各种同分异构体间的相互转变6.连接酶类：催化一切必须与ATP分解相偶联，并由两种物质合成一种物质的反应。（二）国际分类编号方案第一个数字：酶的类别第二个数字：酶的亚类第三个数字：酶的亚-亚类第四个数字：

50、酶在亚-亚类中的排序编号前冠以EC，是国际酶学会缩写 6.酶的化学本质以及与一般催化剂的共性和特性答：化学本质：酶是活细胞合成的生物催化剂，绝大多数的酶是具有催化活性的蛋白质，有些RNA也具有催化活性。酶与其它催化剂的共性：（1）催化效率高（2）只改变化学反应的速度，不改变化学反应的平衡（3）降低反应所需的活化能酶作为催化剂的特性（1）比非酶催化剂效率高（2）作用条件温和（3）具有高度专一性7.酶作用的专一性的类型有哪些专一性是酶区分底物分子与底物类似物分子的能力。反应的专一性保证了产物的纯度 (几乎可以达到 100%)。类型有如下：1、结构专一性（非立体化学专一性）：键专一性：外切核酸酶基团

51、专一性：-D-葡萄糖苷酶绝对专一性：O6-甲基鸟嘌呤转甲基酶2、立体异构专一性：旋光异构专一性几何异构专一性光学异构专一性8.酶作用的专一性假说诱导契合学说酶与底物在相互作用过程中，底物诱导酶活性中心发生构象变化，底物分子中的敏感键产生张力并“变形”。诱导契合学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而是在酶与底物的相互作用过程中，底物诱导酶活性中心发生构象变化，从而使酶和底物契合而形成酶-底物络合物，并引起底物发生反应。9.酶活性中心的定义、组成/结构、共同特征酶的活性中心定义：是指酶分子上直接与底物结合，并进行催化作用的部位。包括：结合部位：酶与底物结合的部位，决定酶的专一性。 催化部

52、位：参加催化的部位，决定酶的催化能力。酶活性中心的组成：（1）单成分酶的活性中心由酶蛋白上的少数几个氨基酸组成。双成分酶中，除了酶蛋白上的几个氨基酸，辅基或辅酶分子上的某一部分往往也参与活性中心的组成。活性中心的基团都是必需基团。酶活性中心的共同特征：（1）活性中心只占酶分子中很小的一部分（2）活性中心具有三维结构，多肽链的盘绕折叠使得这些氨基酸残基得以在空间上接近，并形成适当的三维结构。（3）活性中心由疏水氨基酸形成口袋，极性氨基酸参与反应。（4）底物靠弱键与酶结合（5）活性中心的氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，甚至不在一条多肽链上。10.过渡态学说是什么？答：“过渡态”是底物分子被激活

53、的不稳定态，不同于反应中间物，它具有最高能量，又处在一个短暂的分子瞬间。过渡态出现在反应物的化学键处于即将生成或断裂的过程中，能生成产物或再返回生成反应物。酶能短暂地与反应物结合形成过渡态，从而降低了活化能，但不改变反应的G。过渡态学说是指反应中，酶E与底物S形成不稳定的过渡态ES*复合物，ES*再分解成产物P和酶E，即E+S ES* E+P11.酶降低反应活化能的原因:一.酶降低反应活化能的关键原因是过渡态稳定作用(1)一个酶的活性中心应该在形状和化学性质上与底物的过渡态互补。(2)酶与底物之间的最多、最强的反应只能发生在ES中。(3)所有能够稳定ES的因素都能够加速反应。 (4)减少的活化

54、能（X）实质是额外能量的补充。其中：大部分来自于酶与底物的特异结合、定向所产生的能量；少部分来自于各种催化作用。二. 酶降低反应活化能的原因(1)酶与底物的结合:邻近效应与定向效应;酶与底物间的弱相互作用(2)酶活性中心的疏水微环境(3)酶对底物的催化 酸碱催化 共价催化 金属离子催化(4)酶通常使用几种催化机制12.米氏方程的应用及意义（应用题）意义：(1)酶的特征常数: 只与酶的性质有关。(2)判断酶活性中心的性质: 近似表现酶与底物的亲和力; 酶的专一性、最适底物。 可以利用米氏方程计算出KM （米氏常数）；Vmax （最大反应速度）；kcat （酶的转换数）kcat / KM （酶催化

55、效率的度量），为实际的生产和生活提供理论和实践的依据。三种题型（1）如果要求反应速度v达到Vmax的99%，其底物浓度应为： v= VmaxS /（KM+S） 99% Vmax = VmaxS /（KM+S ） 99% × （KM+S）= S S=99 KM（2）已知某个酶的S=3KM ，求反应速度v相当于Vmax的百分率。 v = VmaxS/ (KM + S) v = Vmax· 3 KM / (KM + 3 KM ) v = ¾ Vmax v = 75% Vmax（3）一个酶促反应中，反应速度与底物浓度的值如下：S (mmol· L-1): 2.0

56、 3.3 5.0 10.0v (mmol· L-1 min-1): 2.5 3.1 3.6 4.2 （1） 请用双倒数作图法计算KM和Vmax并画图。（2）如果酶的浓度为4×10-5 mmol· L-1，请计算kcat（提示：kcat是每秒每个活性中心的反应速度，单位是s-1）。 1/S: 0.50 0.30 0.20 0.10 1/v : 0.40 0.32 0.28 0.24 KM = 2.0 mmol Vmax = 5.0 mmol-1 min-1 kcat = Vmax ÷ E = 5.0 mmol-1 min-1÷ 4×10