多靶点pCRISPR载体改良版(单子叶植物用)使用方法(P)副本

1、CRISPR/Cas9-based genome editing technologyA CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of gene sites in monocot plants 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 华南农业大学 生命科学学院 刘耀光课题组（ygliu）1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图2 相关载体图谱2.1 CRISPR/gRNA vectors (单子叶植物用) (sgRNA: single guide RNA,简称gRNA)：注：用载体骨架长片段隔开U3/U6启动子和gRNA区

2、可避免未切断质粒被PCR扩增（短时延伸20秒)见后面）。这些质粒在E.coli DH10B繁殖。 2.2 CRISPR/Cas9双元载体(单子叶植物用)pYLCRISPR/Cas9-MH，原命名pYLCRISPR/Cas9-MTmono (M=monocot; H=HPT，抗潮霉素基因) pYLCRISPR/Cas9-MB (B=Bar, 抗草苷膦基因) 本套载体系统的pCas9为本实验室设计合成的植物优化密码子基因。双元载体骨架（LBRB非T-DNA序列）为pCAMBIA-1300(ACCESSION: AF234296)与以前的载体相比，这2个载体改造了原来的融合型ccdB即LacZ/cc

3、dB为ccdBs(shorten ccdB,即删除了LacZ序列)及其相对方向反过来，其它部分不变。注： 这些质粒保存在 E. coli TOP10F(LacIq) 菌株繁殖，以使ccdB(大肠杆菌致死基因)能够被LacIq 产生高水平阻碍蛋白抑制其表达。 3. 基因组靶位点选择和双链接头设计3.1 靶位点选择（1）在目标区如果能够找到NGG上游第20碱基是A（用U3启动子）或G (用U6ac启动子）的序列 (A，G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基），优先选为靶序列合成接头的形式（左：连接U3启动子；右：连接U6a启动子） 注意：接头正向引物F和反向R命名命名是根据靶点在gRNA表达盒的连

4、接方向决定，不是基因方向决定，否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向; 另外注意设计引物（尤其反向引物）时的5-3方向。（2） 如果在NGG上游第20碱基不是A或G，可选20碱基为靶序列（参考Kabin Xie and Yinong Yang， 2013， Molecular Plant)合成接头的形式（连接U6a启动子）也就是说，所用启动子的转录起始点与NGG上游第20碱基相同的靶点就是19碱基(19+A/G=20)，不相同的靶点就是20碱基。（3）为了提高突变效率，可以对一个目的基因设计2个靶点(尤其只有一个靶基因)。建议在ORF 5区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变

5、都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。靶点序列GC%偏高可提高打靶效率，因此靶点最好含有11-14个C/G（包括U6转录起始点G）。几个靶位点设计例：左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF上游，或在特定的功能域 (可能引起密码子缺失和移码)右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切）（4）靶点特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一产生有负面作用的非特异打靶，把突变体与原受体亲本杂交（和回交）就可分离排除非特异打靶位点），但应该将候选靶序列+NGG（上下游加几十碱基）对目标基因组做Blast (选Somewhat similar

6、 sequences (blastn)，避免在靶序列3端+NGG与其它功能基因和基因组序列有相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。3.2 靶位点接头引物设计例4. 多靶点pYLCRISPR/Cas9-MH (B)载体构建4.1 gRNA表达盒构建示意图 4.2 靶点引物接头与gRNA表达盒的实际连接方式和扩增为了提高接头连接效率，使用较高浓度（0.05-0.1 mM）的靶点接头，实际上大部分产生线性单端连接，而环状(双端)连接较少。另外，过度酶切，星活性，过度连接等可能产生破坏的平滑末端，有可能连接产生双接头产物或的空载产物（下图的产

7、物IV和产物V）。连接接头后，有3种方法扩增gRNA表达盒片段：（1）直接用位置特异引物做一轮PCR扩增; （2）做2轮巢式PCR，第一轮PCR用通用的U-F/gRNA-R做1个反应，第二轮用位置特异引物扩增；（3）做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gRNA-R；第二轮为Overlapping PCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。方法（1）效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。方法（2）的扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物IV和产物V。方法（3）虽然第一轮PCR需要做2个反应，但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V

8、，因此推荐使用方法（3）。下图为方法（3）示意图。在第一轮PCR加热过程中（73-75度），有缺口的引物（Tm值低于U3/6和gRNA序列）先解离， U3/6和gRNA序列3端（未解离）立即延伸补平，产生接头引物互补结合位点。 4.3 gRNA表达盒扩增引物第一轮PCR扩增引物（所有gRNA表达盒共用）：U-F: 5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3; gRNA-R: 5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3第二轮PCR扩增引物（使用策略I Golden Gate ligation的位置特异gRNA表达盒专用）：（B1, B2, B2, B3, B3等表示各连接点位置；

9、 ctcg, tcag等表示Bsa I 切点粘性末端的正链序列;相同颜色的BsaI切点粘性末端是可特异配对连接的互补末端）靶点1（T1）： SpeI（new）Uctcg-B1: TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3（U3/6上游引物）gRctga-B2: AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3（第二轮gRNA下游引物）T2: Uctga-B2: TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRaaga-B3: AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCC

10、AAGCTC-3 T3:Uaaga-B3: TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRgact-B4: AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T4: Ugact-B4: TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRggac-B5: AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T5: Uggac-B5: TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRtctg-B6: AGCGTGggtctcGcaga

11、GGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T6:Utctg-B6: TTCAGAggtctcTtctgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRaggt-B7: AGCGTGggtctcGacctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T7:Uaggt-B7: TTCAGAggtctcTaggtCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRcgct-B8: AGCGTGggtctcGagcgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T8:Ucgct-B8: TTCAGAggtctcTcgctCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 (如果要多于8个靶点，通过设计不同的

12、BsaI切点碱基，合成新引物对）最后靶点(Last site) MluI（new）gRcggt-BL:AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 （与载体RB侧B-R互补）当靶点数少于8个时，gRcggt-BL（BL）作为最后一个gRNA表达盒下游引物替代B2,B3, B4.，见以下引物使用方法)4.4 靶标gRNA表达盒排列和扩增引物使用方法本系统目前使用水稻来源的4个small nuclear RNA启动子（OsU3, OsU6ac）。当连接靶点多于4个时，为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性，使相同启动子间的距离尽量近（2个相邻的同

13、向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的1/2）。因此建议U3、U6ac启动子的使用和排列方式为：1个靶点：LacZ-U32个靶点：LacZ-U3U6a3个靶点：LacZ-U3U6aU6b4个靶点：LacZ-U3U6aU6cU6b5个靶点：LacZ-U3U3U6aU6cU6b6个靶点：LacZ-U3U3U6aU6aU6cU6b7个靶点：LacZ-U3U3U6aU6aU6bU6cU6b8个靶点：LacZ-U3U3U6aU6aU6bU6bU6cU6c靶点接头设计：由于靶点接头的正向引物的5端4个碱基是根据使用的不同启动子而不同的，因此要确定那个靶点使用那个启动子的基础上合成其正向

14、引物。特定位置gRNA表达盒引物使用方法 (U#=U3, U6ac)：1个靶点：用引物对B1/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA;2个靶点：用引物对B1/B2, B2/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA;3个靶点：用引物对B1/B2, B2/B3, B3/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA;4个靶点：用引物对B1/B2, B2/B3, B3/B4, B4/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA, U#-T4-gRNA 5个或以上靶点： 如此类推。4.5 靶标gRNA表达盒

15、与pYLCRISPR/Cas9-MH(B) 的连接方法本载体系统可采用2种策略进行Cas9载体和多个gRNA表达盒片段的一次连接组装： 策略I用Golden Gate cloning (ligation)方法 (Engler et al., 2008; 2009)； 策略II用Gibson assembly方法(Gibson, et al., 2009, 2010)。Golden Gate ligation是利用Bsa I (type IIs restriction enzyme)的识别位点和切割位点不重叠的特性，可以设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端（256-16=240种，减去的16种

16、是回文结构；第6-7页的PCR扩增引物使用了16种）。多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接（如下图, 4个表达盒为例)，而非连接点的末端之间不互补不能连接（相同末端分子间也不互补不能连接），因此连接反应是向着目标单方向进行，效率很高。由于OsU3上游附有LacZ标记基因(198 bp)，可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆，达到绝对真阳性。策略II见后面介绍。操作流程图注：由Uctcg-B1导入的载体唯一Spe I位点是特别留的一个“后门”，其用途是，在构建好一组目的靶点gRNA表达盒的载体的基础上，如果情况需要再添加第二组其它靶点gRNA表达盒，可以用Spe I将

17、载体切成线状，再用策略II（Gibson Assembly，见后面）将第二组靶点gRNA表达盒克隆进去。5 多靶点载体构建详细操作方法（策略I）：（1）菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9-MH (B)菌种(TOP10F)和CRISPR/gRNA vectors 菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素（25g/ml）和氨苄青霉素（50g/ml）平板培养基划出活化单菌落，取单菌落培养1ml种子液（不要将保存的菌种直接接种子液！），再扩大培养用于提取质粒。 pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 载体较大（约16.5 kb），拷贝数较低（pBR322复制子），用质粒小型柱提取纯

18、化的回收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒（如TIANGEN公司EndoFree Maxi Plasmid Kit）提取纯化（由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇，且体积大浓度低，最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积），或用普通碱裂解法提取（用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀）。溶解在TE（约0.5mg/ml）保存。取部分质粒稀释成约100 ng/ml冷冻保存，作为步骤（10）使用。由于BsaI是很容易失活的酶（有时新买的BsaI是失活的！），在进行以下步骤之前，先检测BsaI活性： 配制10 l BsaI反应液，含有5U BsaI, 10

19、0 ng pYLgRNA-U# (或其它有AmpR基因的质粒)。3715min后电泳检查（也电泳50ng未切的相同质粒为对照）。pYLgRNA-U#的BsaI图谱见第2页。最好把BsaI分装成几管冷冻保存。(2) （推荐使用以下4+5步骤边切边连方法，这个步骤只做参考，如果采用边切边连方法，不需要执行这个步骤）取约2-3 ug pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 在50 l（30U BsaI）酶切30 min, 用低熔点胶电泳回收酶切的质粒片段（去除ccdB片段）（不要用太多酶或太长时间过度酶切）。 用0.5x TE洗回收胶30分钟，65 3 min熔解，在40 加入Agarase（1

20、U/100l胶， NEB)处理30分钟后，分装成每管40-60ng（2-3 l）冷冻保存公用（一管做一次连接，以避免多次冻融）。（3）靶点接头制备：将接头引物TE溶解成100 M母液，各取1l加入到98l 0.5x TE混合稀释到1 M。约90 30 S，移至室温冷却完成退火。（4）gRNA载体酶切：取pYLgRNA-OsU3/LacZ 等质粒各约1 ug，在25l反应用10 U BsaI （NEB公司）酶切20 min（不要用太多酶或太长时间过度酶切），70 5min失活酶。冷冻保存公用。（5）gRNA表达盒连接反应：酶切过的pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒与各所对应接头连接反应：

21、1 l 10x T4 DNA ligase buffer； 0.5 l (20 ng) pYLgRNA-OsU#质粒； 0.5 l接头（最终浓度0.05 M) 加 ddH2O至 10l最后加约2035 U (0.050.1 l) T4 DNA ligase (Takara，其它公司的T4 DNA ligase单位定义不同，但每l的酶活相当) 室温（20-28 ）连接约10-15 min（过多DNA ligase和过长时间连接会产生较多第6页所述产物IV &V !）（4+5）步骤4、5结合的简化（边切边连法）方法：配制10 l 1x BsaI酶切连接反应液：在1x Bsa I-内切酶Bu

22、ffer中加入ATP至终浓度0.51.0 mM，加入约20 ng pYLgRNA-OsU#质粒（预先配好20 ng/l保存），0.5 l接头（最终浓度0.05 M），5 U BsaI，35 U T4 DNA ligase（此buffer对Bsa I和ligase都有效）。如果实验室没有ATP，在1x内切酶Buffer中加入0.20.3 l 10 x NEB T4 DNA ligase buffer（10x NEB T4 DNA ligase buffer中含有10 mM ATP, 但10x Takara T4 DNA ligase buffer中含有1.0 mM ATP，因此优先用NEB的；或

23、加1l 10 x Takara T4DNA ligase buffer）。注意：没有加内切酶buffer而单纯加T4 DNA ligase buffer缺少KCl或NaCl，不适合Bsa I酶切！）。用变温循环仪（或PCR仪）循环反应5循环：37 5 min，20 5 min。(6) 扩增gRNA表达盒（虽然用第二轮PCR的位置特异引物直接从连接产物也可以扩增出目标产物，但用2轮PCR扩增可以更稳定地得到特异性目标产物且能避免空载产物扩增，见第6页）（a）第一轮扩增（每个gRNA表达盒2个PCR反应，各15 l）：取1 l连接产物为模板，使用第6页引物U-F/接头反向引物（反应1），和接头正向

24、引物/gRNA-R（反应2），各0.2 M, 适量高保真PCR酶，最好使用KOD-Plus (TOYOBO)，保真度最高且性价比高，或KOD FX，或Takara ExTaq。不要使用能在产物3附加A碱基的Taq酶，此A碱基使产物在第二轮PCR中不与互补链配对而不能延伸补平）。 25-28 循环：95 10s，60 15s ，68 20 s (任意) 取 4 l电泳检查（反应2产物长度约140bp，最好用PAGE检查，或用2%琼脂糖胶）。如果扩增产物较弱，也可以继续第二轮PCR。（b）第二轮PCR： 按第6-7页所示，预先将位置特异引物对混合成10 x工作液，每种1.5 M： B1 + B2

25、(PT1); B2 + B3 (PT2); B3 + B4 (PT3)； B4 + B5 (PT4)； B5 + B6 (PT5)；B6 + B7 (PT6)；B7 + B8 (PT7)； B1 + BL (PT1L); B2 + BL (PT2L); B3 + BL (PT3L); B4 + BL (PT4L); B5 + BL (PT5L); B6 + BL (PT6L); B7 + BL (PT7L); B8 + BL (PT8L)。 引物组合1个靶点：PT1L；2个靶点：PT1，PT2L；3个靶点：PT1，PT2，PT3L;4个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4L;5个靶点：PT1，

26、PT2，PT3，PT4，PT5L;6个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6L；7个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7L；8个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7，T8L取第一轮PCR反应1，2产物1l用H2O稀释10倍，各取1 l混合为模板。各表达盒20-50 l PCR (1个靶点50l； 2-3个靶点各30l；4个或以上靶点各20l)。加入1/10量每种引物组合工作液（最终浓度0.15M）。使用适量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。扩增15-20 循环(实际情况调整)：95 10s，58 15s，68 20 s。取 2

27、-3l电泳检查产物长度是否符合，并估计样品的大致浓度。注：各种启动子gRNA表达盒的长度为（括号为Bsa I切后）：U3-gRNA=767 bp(728 bp); U6a-gRNA=629 bp(599 bp); U6b-gRNA=515 bp(485 bp); U6c-gRNA=924 bp(984 bp)。（7）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化(除去Taq酶以防止下步骤补平BsaI酶切末端)。（8）（如果采用步骤10方法II，不需要此步骤8和9）混合产物在50l BsaI反应，用20 U BsaI 37 酶切30 min，73 2

28、min（使切出的13 bp末端小片段变性，以减少连接竞争）。用PCR产物纯化kit纯化，以去除切出的13/17碱基末端片段以防止连接竞争。（9）方法I：在切好分装（步骤2）的pYLCRISPR/Cas9-MH (B) (约60-80ng）管中，加入相当于每个靶点约10-15 ng的步骤（8）酶切PCR产物(如1个靶点约10ng、 2个靶点共20-30ng、 3个共约40-50 ng、 4个共约60-70 ng、更多靶点时每个片段的量适当增加（最多15ng/片段）,不要加入过多的gRNA表达盒片段。这样载体与每种插入片段摩尔比=1: 4-6) ，在10 l 连接反应（加35 U连接酶，不要过多连

29、接酶）， 16 （或最好用变温循环: 10 5min，20 5 min；10-15循环）连接2-3h（不要过长时间连接）。做3个以上靶点Cas9载体构建时，最好把Bsa I切好的多个gRNA表达盒混合片段（先不加pYLCRISPR/Cas9-MH (B)片段）先在20连接约3 min将其连接成一个片段，再加入pYLCRISPR/Cas9-MH(B)片段(约60-80ng），再连接2-3个小时。（10）方法II（边切边连法）：作为步骤8，9的简化替代操作，从步骤（7）取约20-70 ng 产物（参考步骤9中gRNA表达盒片段使用量），加入约60-80 ng 未切割的pYLCRISPR/Cas9-

30、MH (B)质粒（预先稀释成约100 ng/ml冷冻保存），在15 l反应（1x Bsa I-内切酶Buffer）用10 U BsaI 37 酶切10min（不要过多BsaI和过长时间，否则载体会产生破坏平滑末端而自连）。（不要失活Bsa I !）加入ATP至终浓度0.51.0 mM。如果实验室没有ATP，加0.5 l 10 x NEB T4DNA ligase buffer (或1.5l 10 x Takara T4 DNA ligase buffer)，和35 U ligase（不要过多连接酶）。 用变温循环酶切连接约10-15循环: 37 2 min；10 3 min，20 5 min；

31、最后37 2 min。此方法要点：由于没有去除Bsa I切出的13/17碱基小片段和ccdBs片段，它们会被竞争连接回原来的位置。此变温边切边连反应能把连接回去的片段再次被Bsa I切除，而连接好的目标产物序列由于不存在Bsa I的识别位点不会被切断。此方法简便效率高，阳性克隆率高，推荐优先使用。（11） 电激法转化：将连接产物滴载在悬浮式透析膜Millipore VSWP04700（0.025m孔径）对1/5 x TE透析1530 min（最好在4冷柜内）脱盐（或用乙醇沉淀，70%乙醇洗，风干溶在5 l 去离子水），取1-1.5l连接产物电激转化E. coli DH10B 感受态细胞（虽然其

32、它菌株也可以用，但DH10B更适合高效率电激转化大质粒。电激转化感受体态细胞制备最好用SOB培养（不要用LB培养），以10 pg pUC18质粒转化测试转化效率（小质粒用电激电压1800 V/20l感受态细胞/1l电激杯），要求达到效率>109 colonies/1g pUC18(即电激10 pg质粒，涂1/20 转化细胞出500以上菌斑)。 >15kb大质粒的电激电压为1500-1600 V/20l感受态细胞/1l电激杯（或2500V/40l感受态细胞/2l电激杯）；电激后加入1ml SOC (不要用LB)）,37培养1-1.5h。涂板培养基为LB+ 25g/ml Kan, 0.

33、30.5 mM IPTG (使用Lac Iq基因型菌种用1.0 mM)，适量X-gal。IPTG诱导没有彻底切除ccdBs的空载质粒转化子的ccdBs表达致死。而含有目标插入序列（LacZ-OsU3-gRNA表达盒）的阳性克隆由LacZs表达产生蓝色菌斑。注意：白色且生长大小正常的菌斑是已切除ccdBs但末端破坏平端连接的空载克隆，或ccdBs功能突变（有约1/1000频率发生）但未切除ccdB的空载克隆。化学熱激法转化也可以获得阳性克隆，但效率较低。因此，有电激仪的实验室应该使用电激法。（12）阳性克隆确认：用常规碱裂解法提取质粒，取约100ng（20l反应）用MluI（由LacZ-OsU3

34、表达盒和BL引物导入Mlu I位点）切出串联的gRNA表达盒片段（以未切的空载环状质粒为对照）电泳检查其大小是否符合预期（各gRNA表达盒片段大小之和）。如果Mlu I切不动（电泳显示没有插入子片段且带型与未切空载环状质粒相似，即条带较宽拖尾），这是空载体。（如果做以下步骤测序，可不做这个PCR检测）取少量（13 ng）质粒为模板对所有靶点进行PCR检测(也用空载质粒做阴性对照)。引物配对形式为：SP-DL引物与第一靶点接头反向引物配对；第一靶点接头正向引物与第二靶点反向接头引物配对；第二靶点正向接头引物与第三靶点接头反向引物配对；第三靶点接头正向引物与第四靶点反向接头引物配对；如此类推，最后

35、靶点正向接头引物与SP-R引物配对。这样每个靶点的正反方向都检测过一次。电泳确认其大小是否符合预期。（13）测序检测：（如果通过步骤12 PCR检测阳性，可不做测序）利用各靶点引物的特异性，按下图方式对特定靶点进行测序. 注意：由于U6c比较长（742bp），用前一个靶点正向引物不一定能测通U6c到靶序列（T#），如果U6c是最后一个表达盒，要用SP-R (见第2页)进行测序；如果U6c不是最后一个表达盒，用其后面的靶点反向引物测。（最好提醒测序公司，这是中低拷贝的较大质粒，以便公司采取相应措施）。（14）在农杆菌的稳定性检测(任意步骤)：获得的克隆电激转化农杆菌（EHA105），从农杆菌提取

36、质粒（农杆菌提取质粒质量较差，只适合做PCR），取约2-5 ng质粒为模板再用所有靶点接头正向引物和反向引物配对进行PCR确认。或将质粒转化DH10B，再提取质粒酶切分析。(15) 打靶效果检测：打靶成功往往在靶点缺失若干碱基。以靶点切点为中心，在两侧各离开约150 bp处合成引物。可将T0或T1植株的靶点PCR产物不经克隆直接测序。从测序出现杂波峰或突变型波峰判断突变状态。策略II: 基于Gibson Assembly的gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH(B)的连接方法 Gibson 等开发了一种“isothermal in vitro recombination react

37、ion”，也称为 “Gibson Assembly” 可进行多个PCR片段的连接(Gibson, et al., 2009; Gibson, et al., 2010; Gibson, 2011)。商业的连接克隆试剂盒“Gibson Assembly Kit” (NEB)就是基于此技术, Takara的In-Fusion 使用不同酶系，原理相似，也可以达到相同目的，但这些试剂盒很昂贵！（1500-1700元/10次反应）。本实验室利用自制的isothermal in vitro recombination reaction mixture (见以下，成本非常低)，可进行质粒载体的多个片段同时克

38、隆和缺失（Jiang et al., 2013. One-step cloning of intron-containing hairpin RNA constructs for RNA interference via isothermal in vitro recombination system. Planta 238, 325-330; Zhu et al., 2014. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene 548, 3942）。以下介绍基于Gi

39、bson Assembly的CRISPR/Cas9多靶点载体的构建。(1) 根据在一个载体构建靶点数的需要，合成以下引物对（gR-L是最后一个gRNA表达盒用）。以下相同颜色表示连接配对序列，右端斜体表示与U3/6启动子上游配对序列，方框为各种通用引物配对位点，测序检验阳性克隆时测序公司可以提供这些通用引物。Spe IUp-T1: ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3(下划线与GAS-L配对)gR-T1: CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (Ptac prom

40、oter F primer site)Up-T2: GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T2: CCACGCATACGATTTAGGTGACACTATAGCGCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (Sp6 promoter primer site)Up-T3: CGCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGCGTGGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T3: GTCGCTAGTTATTGCTCAGCGGCCAAGCTCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (T7 terminator F primer

41、 site)Up-T4: GAGCTTGGCCGCTGAGCAATAACTAGCGACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T4: CATCGTCGCCGTCCAGCTCGACCATTGAACATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (EGFP-N primer site)Up-T5: GTTCAATGGTCGAGCTGGACGGCGACGATGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T5: GCTCCGAATACGACTCACTATAGGGTGACCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (T7 universal primer site)Up-T6: GGTCACCCTAT

42、AGTGAGTCGTATTCGGAGCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T6: CTGAGGTTAACCCTCACTAAAGGGAAGCTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (T3 Promoter primer site )Up-T7: GGAGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAACCTCAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T7: CGTGGTATGCTAGTTATTGCTCAGCCTCGACATCCACTCCAAGCTCTTG-3(T7 terminator R primer site)Up-T8: GTCGAGGCTGAGCAATAACTAGCA

43、TACCACGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3（gR-R为右侧最后一个表达盒反向引物。如1个靶点，Up-T1与gR-R配组；2个靶点，Up-T2与gR-R配组；3个靶点，Up-T3与gR-R配组，.如此类推）gR-R: TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (下划线与GAS-R配对) Mlu I （以上引物对单双子叶植物用Cas9载体通用）为方便操作，参考11页模式预先混合好引物组。注：由Up-T1导入的载体唯一Spe I位点是特别留的一个“后门”。其用途是，当构建好第一组目的靶点gRNA表达盒的载体后，如果情

44、况需要再添加第二组其它靶点gRNA表达盒时（或靶点数目较多，一次连接所有gRNA表达盒不能成功，可以把它们分成2组连接）。可以用Spe I将载体切成线状，再继续用Gibson assembly将第二组靶点gRNA表达盒克隆进去。第二组靶点gRNA表达盒的扩增需要用gR-R2替代gR-R（Up-T1不变）。也可以利用此位点（或策略I构建载体留的Spe I位点）插入其它目标基因片段。 Mlu I gR-R2: TGTCAACGCGTCCTTTGCTGCCGATTCCAGGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (第一组T1-gRNA表达盒使用了LacZ-OsU3启动子)。如果第一组的T1-

45、gRNA表达盒不是用LacZ-OsU3启动子，gR-R2的 5端的TGTCAACGCG要替换成如下碱基： OsU3: AAAGATTCCT; OsU6a: CAGGAAAAAA; OsU6b:TGCAAGAACG; OsU6c:CGCTAATGAG（这是各不同启动子的5端10 bp，作为连接位点的一部分，见附录序列）。其它Up-T#/gR-T# 的使用原理与第一组的相同，但不能重复使用第一组用过的Up-T#/gR-T# （Up-T1可以再使用）。如果是有计划分2组克隆，建议将LacZ-OsU3启动子留在第2组使用，因为第2组克隆的难度大些，可利用LacZ帮助筛选阳性克隆。如果第一组靶点gRNA

46、表达盒是用策略I构建的，第二组靶点gRNA表达盒的克隆就使用Spe I切开载体，使用Up-T1b (ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGGAATCGGCAGCAAAGG-3)替换Up-T1。 gR-R2的序列（及其10碱基替换，如果需要）与以上相同。（2）自制Isothermal in vitro recombination reaction mixture：5X isothermal（ISO）reaction buffer：25% PEG-8000，500 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，50 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，4种dNT

47、Ps 各1 mmol/L，5 mmol/L NAD，20 °C保存。2X master mixture：160 L 5 × ISO buffer, T5 Exonuclease (Epicentre) 1.5 units（严格控制T5 exouclease酶量，不能过多！过多T5 exouclease会造成DNA片段被快速降解），Phusion High-Fidelity DNA polymerase (NEB) 20 units, Taq ligase (NEB) 2000 units, deionized water to 0.4 mL。多管分装20 °C保存

48、（3）参考第7页指引设计U3/6启动子排列。但如果是4个靶点，建议把较长的U6c用于T3, U6b用于T4,这样可以用SP2测通T4和T3（见以下步骤7）。（4）在50 l反应用20 U Bsa I酶切2 g pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 约30 min。取2l（80 ng）电泳检查，确认被切出的ccdB条带（732bp）。655min失活，每管3l（100120 ng）约分装冷冻保存。（一般不需要回收纯化，也可使用策略I步骤2电泳回收纯化的样品）。（5） 按以上策略I步骤2至步骤6的第一轮PCR同样操作；第二轮PCR使用以上引物对(各引物0.15M)扩增各靶点（T1, T2,

49、T3,.）的gRNA表达盒片段。取2 l电泳检查。（6）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化；或在PCR产物中加入5 U 单链核酸酶Exonuclease I (Takara)在37°C处理10-15 min消除剩余引物（这是为了避免引物与目的片段竞争结合），80°C 20min失活ExoI（以避免消化Gibson反应中产生的单链末端），不需纯化直接取适量进入步骤7。（7）参考策略I步骤9，在分装有pYLCRISPR/Cas9-MH (B)（100120 ng）的管中加入适量的gRNA表达盒片段，加入去离子水至最终量78

50、 l。加入等量78 l 2X master mixture，50 °C反应25 30 min（时间过长可能会造成DNA被T5 exouclease降解！）。可以取10 l连接产物电泳检查，正常反应可见连接的较大片段（见18页图）。（8）参考策略I步骤11-13操作，但在透析膜对1/5 x TE透析较短时间的5-10 min（这是因为ISO buffer含有PEG-8000，过长时间透析会吸收过多的1/5x TE降低连接产物浓度。但不透析直接电激转化容易打炸或电激电流过大而降低转化效率）。 测序策略既可以按策略I步骤13进行，也可以用以上的通用引物Sp6 promoter primer

51、等（测序公司可提供，将这些测序引物序列交测序公司确认）从gRNA往启动子方向进行测序，每个引物可以测通2个靶点。A 6-target CRISPR/Cas9 construct prepared by Gibson assembly 附录序列信息(每个PCR扩增序列为活字)：pYLCRISPR/Cas9-MH (B)克隆位点附近关键序列GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCTCTGAAG(ccdB)GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGGCGCGCCTCTCGAGCTAGCGGCCGCAT

52、GCATCGATCTCCTACATCGTATAAATTAGCCTATACGAAGTTATTGCATCTATGTCGGGPCR扩增的LacZ-OsU3-gRNA单元序列（767 bp, Bsa I酶切后737 bp）： TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAGGCAGCTATGctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaag

53、aggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcTAAAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCT

54、TTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA(19-20pb靶序列）GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGG CACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGACCNNNNCGAGACCCACGCT PCR扩增的OsU3-gRNA单元序列(564 bp, Bs

55、a I 酶切后534 bp)TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATA

56、AACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA (19-20pb靶序列）GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT TTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGACCN

57、NNNCGAGACCCACGCT PCR扩增的U6a-gRNA单元序列（629 bp, BsaI酶切后599 bp）： TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGATTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTAT