槐花米中芦丁的提取分离与鉴定

1、槐花米中芦丁的提取分离与鉴定实验一预试；背的碱提取，酸沉淀；薄层层析铺板。实验二产品的精制:重结晶；晋的水解。实验三昔、昔元的定性鉴定；试、试元的tlc鉴定；糖的纸层 析鉴定。槐花米中芦丁的提取分离与鉴定（-）预试；昔的碱提取，酸沉淀；薄层层析铺板。（二）产品的精制:重结晶；甘的水解。（三）昔、昔元的定性鉴定；貳、貳元的tlc鉴定；糖的纸层 析鉴定。教学目的：1.掌握酸碱法提取黄酮甘类的原理及方法。2. 掌握化学鉴别试验、背水解、薄层层检查等手段在苜类结构鉴定上的作用。已知重要成分及其性质1.芦丁（芸香rutin）淡黄色针晶，水屮结晶者含3分结晶水，c27h30o16-3h2o loommhg

2、和11o°c 加热12小时后，变为无水物，无水物于25°c变棕，1157°c软化，2145°c发 泡分解，lg芦丁溶于约3ooml冷水，200ml沸水，7ml沸甲醇，溶毗噪，甲酰胺 和碱液，微溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿，二硫化碳、乙瞇、苯和石 油瞇。2. 榊皮素(guereetin)为芦丁的苜元，ci5h|0o7, mw302.23；含二分子结晶水为黄色针晶，（稀乙醇），57°c失水，314°c解，lg溶于290ml无水乙醇、23ml沸乙醇，溶于冰醋-般在碱水中溶解显黄色，几不溶于水。r=glu一 rhar= oh芦丁懈皮素

3、3. 皂昔(saponin)易溶于毗呢。能溶于200倍的甲粗品为白色粉末，mp210°c20°c （dec）o醇，酸水解得下列两种背元及糖。糖为葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄醛酸内酯。（1）白桦酯醇（betulin）无色针晶，mp2152°c,能溶于醋酸,丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、苯等；难溶于右油醯和水。(2) 槐花二醇(sophoradiol)无色针晶, 醯、苯、丙酮、甲醇、难溶于水。整套实验的过程：预试提取分离鉴定实验一 预试；貳的碱提取，酸沉淀实验目的 通过系统预试，了解检品中含有哪些类型的成分，对能含有哪些化学类型的 成分，为进一步提取分离冇效成分捉供线

4、索。 实验原理 原理：芦丁即芸香貳，它属黄酮貳类，其分子中的酚径基呈弱酸性, 可用碱溶、酸沉淀的方法进行提取。再利用它易溶于热水、热甲醇，难溶于冷甲 醇的性质分离精制。实验内容 预试；昔的碱提取，酸沉淀；薄层层析铺板。实验所用试剂及仪器：试剂：槐花米15g+lg, 乙醇， 镁粉，浓盐酸，1%三氯化铝，3%三氯化铁 乙醇溶液，10%口一蔡酚醇液，蒸馆水，硅胶g, 0.3%0.5%cmc水溶液 仪器：研钵天平试管水浴装置（70°c） 过滤量筒滤纸，200目尼龙 布，电炉，真空泵，布氏漏斗，剪刀，玻璃板，铺板器，薄层板放置架，漏斗实验步一、预试：（-）意义：通过系统预试，了解检品中含有哪些

5、类型的成分，可能含有哪些 化学类型的成分，为进一步提取分离有效成分提供线索。（-）实验内容：1. 记录待预试天然药物（以卜均称检品）的学名、植物來源、药用部分及特征 （如色泽、嗅、味等）。2. 将检品研成粗粉或剪切成碎块（如为新鲜品，应先在60°c左右的温度干燥）。3. 预试液的制备：（1）乙醇提取液的制备 称取检品（如槐花米）lg,压碎于试管中加乙醇10ml, 在70°c水浴上浸渍20分钟，过滤，滤液供以下试验（其屮喷三氯化铝、三氯化 铁各用一张经圆形滤纸层析后的滤纸片）（2）预试实验： 镁粉一盐酸反应 量取检品液2ml加入镁粉少量及浓盐酸45滴，放置（或 于水浴中加热）

6、，观察红色产生（即可认为可能含有黄酮类化合物） 三氯化铝反应 取检品液1滴加1%三氯化铝溶液12滴，出现黄色，且荧光 加强。（也可将醇提取液滴于滤纸上，喷以1%三氯化铝溶液，再同以上进行观察 比较）取检品液1滴滴于滤纸上，在其旁滴一滴1%厂氯化铝溶液，在两液融合 处出现黄色 （可能含有3oh、4-c=o或5-oh> 4-c=o或邻二酚oh） 三氯化铁反应 将检品液滴于滤纸屑上，喷上3%三氯化铁乙醇溶液，出现绿、 蓝或棕色斑点。取滤液滴于滤纸上，在英旁滴一滴3%三氯化铁，在两液融合处 棕色斑点 （含有酚-oh） q蔡酚反应（molish反应）取乙醇提取液lml,加10% a蔡酚醇液12 滴

7、，摇匀，沿管壁缓缓加入浓硫酸lml,不振摇，两液界面间出现紫色环（此反 应试糖、貳类化合物，反应较灵敏,若有微量滤纸纤维或中草纱粉末存在于溶液 中，也能产生上述反应，故在过滤时应注意）。（可能含有糖或貳）二、提取分离：碱提取、酸沉淀称取槐花米粗粉15g,置于500ml烧杯中,加入沸水250ml及硼砂lg,在 搅拌下加石灰乳调至ph=89保持微沸30分钟，不断补充蒸发掉的水份，以保 持ph=89,趁热用尼龙布拧挤过滤（或抽滤）。残渣再加4倍量的水煎一次，趁 热用尼龙布拧挤过滤（或抽滤）。合并滤液，在60°c70°c条件下，用浓盐酸调 至于ph=45,静置1小时，析出粗制芦丁，

8、抽滤。弃去滤液，沉淀用水洗至中 性，曽空气中晾十得粗品芦丁。（或60°c十燥得芦丁粗品）。抽滤时应注意：1）利用虹吸，将表而清液吸去，挨近沉淀表而时改用吸管；2）抽滤，并用少量水洗至中性，得芦丁粗品。注意事项：1 硼砂因能与芦丁结合，既保护邻二酚轻不被氧化破坏，乂能调节碱水溶 液的ph,实验证明提取时加入硼砂，产品质量较较好。2 加石灰水乳既可达碱溶液提取芦丁廿的；还口j以除去槐花米中大量的粘 液质和酸性树脂（或钙盐沉淀），但ph不能过高和长时间煮沸，因其可导致芦 丁的降解。3 ph过低会使芦丁形成佯盐而降低收率。三、tlc铺板薄层板的制备 湿法铺板：用硅胶g （1.5g或2g）和0

9、.3%0.5%cmc水 溶液1 : 34的比例调节成均匀状，倒于5cm* 15cm的玻璃板上或载玻片上, 铺匀，放于水平处，在空气中晾干后，105°c110°c活化30分钟或1小时，活性板置于干燥器保存备用。实验二产品的精制:重结晶；昔的水解实验目的 巩固重结晶的操作和原理，甘水解实验。实验原理 重结晶是利用产品与杂质在某种溶剂中因温度不同而不同的溶解 行为加以分离。芦丁在水屮溶解行为1： 10000 （冷）和1： 200 （热）粗品屮主 要杂质为皂昔酸水解的甘无口桦脂醇和槐花二醇，它们均难溶于水，可利用重结 晶将它们除去。芸香甘的甘键为半缩醛结构，对酸不稳定，对碱较稳定，

10、易被酸催化水解；并且芸香甘甘键是一个酚甘键，由于pr共饥作用，酚甘的甘元在甘键原子质子化时芳环对苜键原子冇一定的供电作用，更易于水解。实验内容产品的精制：重结品；昔的水解。实验所用试剂及仪器：试剂：双蒸水500ml, bmo3细粉i0g, ph试纸，芦丁，2%硫酸80ml,乙醇.水（1： 1） 50ml仪器：抽滤装置（真空泵 布氏漏斗 安全瓶 滤纸）,150ml圆底烧瓶，天平，蒸发皿，一、昔粗品的精制：（重结晶）实验步骤:原理：重结晶是利用产品与杂质在某种溶剂中因温度不同而有不同的溶解行 为加以分离。如：在高温时将粗品溶于某种溶剂中，而其中有些杂质则不溶或难 溶，趁热过滤，即可以除去这些朵质。

11、冷却滤液后所需的产品重新结品出来，而 一些易溶杂质仍保留在溶液屮，再经过滤、洗涤、干燥，即可得纯品。芦丁在水中的溶解行为：1 : 10000 （冷），1 ： 200 （热水），粗品中的主耍朵 质为皂貳酸水解得到的两种貳兀：白桦脂醇和槐花二醇，而它们均难溶于水，可 利用重结晶将它们除去。将粗品芦丁用蒸憾水重结晶，或甲醇水（1 : 1）的混合溶媒重结晶，得芦 丁纯品于60°c-70°c干燥后称量，让算收率。具休操作：1）粗品屮逐量加入热水，观察溶液的澄清度，酌情加入，共加热水约500ml；2）预热布氏漏斗，溶解后的粗品趁热过滤；3）滤液勿搅动，静置冷却析晶，再冰浴充分析晶。抽滤

12、，晶体用少量水冷 洗。（用减压过滤使晶体与母液分离，过滤时尽量抽干。然后用少量的冷溶剂洗 涤晶体，以除去晶体表面的母液。洗涤时应停止抽气，在漏斗上加少量溶剂，以 刚浸没结晶为宜，以减少晶体溶解损失。静置片刻，必要时，用玻棒或钢刀轻轻 翻动品体，待溶剂均匀地浸湿品体后，再抽去溶剂。如此洗涤23次，最后将品 体尽量抽干，最好用清洁的玻璃倒置在结晶表面挤压。另，母液与洗液合并后一 起处理。）6）60°c70°c干燥后称量，计算收率。纯品干燥放置，待下次实验用（室温）。二、昔的水解（1）水解原理：芸香貳的貳键为半缩醛结构，对酸不稳定，对碱较稳定，易被 酸催化水解；并且芸香貳貳键是一

13、个酚貳键，由于pn共辘作用，酚貳的貳元 在貳键原子质子化时芳坏对貳键原子有一定的供电作用，更易于水解。 貳的酸水解、貳元的分离称取芦丁 lg,研细，置150ml圆底烧瓶屮，再加2%硫酸80mlo加热微沸1 小时进行水解，放冷后抽滤，滤液保留作糖的鉴定。水洗沉淀呈中性，再用乙醇 水（1 : 1）混合溶剂重结晶，得貳兀（榊皮素）精品。（称取戒纯品lg,研细，置1501111圆底烧瓶中，再加入2%h2s0480ml,加热微沸， 可见浑浊的黄色溶液逐渐变为桔红色的澄清液体，不久后又开始出现浑浊现象， 颜色再次变为黄色，约1小时后停止加热，稍冷后抽滤，滤液取2om 1,加入充 分研细的bac03细粉，边

14、加边搅拌，不断测ph值，至中性，约加了 bacos细粉10g, 过滤，除掉bas（沉淀，滤液用蒸发皿水浴浓缩至2ml左右，作纸层析样品液。 抽滤所得沉淀用水洗至中性，再用50ml左右的乙醇一水（1 ： 1）重结晶，得忒 元（梅皮素）精品。实验三 昔、昔元的定性鉴定；昔、昔元的tlc鉴定；糖的纸层析鉴定实验目的1.巩固薄层层析等手段在昔类结构鉴定上的应用2.作好糖的纸层析鉴定实验原理pc、tlc、昔及昔元的性质比较实验所用试剂及仪器：试剂：葡萄糖标准品乙醇液，鼠李糖标准品乙醇液，芦丁标准品，懈皮素标准品,止丁醇醋酸水（4： 1 ： 5）,苯胺一邻苯二甲酸试剂（苯胺0.93g和邻苯二甲酸1.6g溶

15、于100毫升水饱和的正丁醇），糖样品液，昔及昔元乙醇液，mg+hcl,zroci2/h+ （1%氧氯化钻甲醇液23滴），2%柠檬酸甲醇液，molish反应（10%a蔡酚醇液，浓硫酸），氯仿甲醇甲酸（15 ： 5 ： 1）, 1%三氯化铁水溶液一1%铁氧化钾水溶液（临用时等体积混合），精制的貳元0.2g ,醋肝6ml和浓硫酸1滴，冰水，95%乙醇仪器：研钵150ml圆底烧瓶，加热装置，抽滤装置，玻棒，普通过滤（漏斗滤 纸）酒精灯（滤液蒸发浓缩至2ml3ml）,新华牌层析滤纸，喷雾器，层析缸， 层析滤纸（新华牌中速层析滤纸），点样毛细管（内径0.5mm）,薄层板，点样毛 细管，喷雾器，干燥器，天平

16、（称取精制的试元0.2g）, 25ml干燥的圆底烧瓶， 滤纸，烧杯（过滤），重结晶装实验步一、糖的鉴定一一纸层析鉴定滤去貳元（榊皮素）后的水解母液，取出20ml,加碳酸倾细粉中，中和时 不断搅拌，至溶液呈屮性，滤去白色硫酸顿沉淀。滤液浓缩至2ml3ml,作纸层 析的样品溶液，和已知糖液作对照，可得到和葡萄糖、鼠李糖相同rf值的斑点, 冇时尚能呈现芸香糖的斑点。样品：1）貳水解后的糖样品液2）葡萄糖标准品乙醇液3）鼠李糖标准品乙醇液支持剂：新华牌层析滤纸展开剂：正丁醇醋酸水（4 ： 1 ： 5）下层饱和12小时，上层展开。显色剂：苯胺一邻苯二甲酸试剂，喷雾后于105°c烘10分钟显色（

17、显棕色 或棕红色斑点）纸层析实验：纸层析是以滤纸为支持剂，用一定的溶剂系统展开而使混合 物达到分离的层析方法。多数情况下，纸层析的分离原理是利用混合物各组份在 两相溶剂中的分配系数不同而得到分离的。由于滤纸纤维可吸收20%25%的水 分，其中6%7%的水和滤纸纤维素上的轻基成氢键结合，形成纸层析中的固定 相。其它溶剂（流动相）可口由通过。纸层析与分配薄层层析一样主要用于亲水 性化合物的分离，与薄层层析比较，它的结果便于保存，但费时。基木操作:1）点样根据样品数量的多少选择宽窄不同的一定规格的层析用滤纸，长度一般为 30cm左右。在距滤纸一端2cm3cm处画一条起始线，用毛细管在起始线上点样,

18、点与点的距离约为2cm左右，点的直径小于3mm。注意点样量要适量。2）展开展开分上行展开、下行展开、径向展开在展开前，即在纸条放入展开剂以前，要先将纸条悬挂于固定相的饱和蒸 气屮放置一段时间。如用甲酰胺作固定相，要预先将甲酰胺固定于纸条上，应先 用20%甲酰胺丙酮溶剂将薄层板展开一次，挥去丙酮后，点样，再用甲酰胺饱和 过的流动相展开。3）显色展开完毕，取出层析纸晾干，显色，计算rf值。显色方法、rf值计算法同 薄层层析4）记录纸层析结果通常作为实验第一手资料，耍求在层析滤纸上端写明实验对象、 条件，算出rf值。具体有以下各项：各编号样品的名称及其rf值；支持剂；展开剂；饱和时间、层析 时间；显色剂；室温；日期；实验者具体实验步骤：层析滤纸的准备一点样一饱和一展开一显色一记录并计算r