制作优质HE病理组织切片的要素

1、制作优质HE病理组织切片的要素病理组织石蜡制片技术是病理诊断的基础， 制片质量的好坏 是指导医师作出准确诊断的重要保证。 常规石蜡制片一般经过取 材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等一系 列的步骤， 一个步骤做不好都会影响组织切片的质量。 本文就我 们科在日常工作中各步骤可出现的问题总结出一些经验和体会， 现介绍如下。1 材料1.1 各类病理组织标本1.2仪器SHANDON-Therm全封闭式组织处理机、包埋机、 切片机。1.3试剂10%畐尔马林、AAF固定液、梯度酒精、二甲苯、石蜡（5860 C）、苏木素、伊红2 方法2.1 取材 临床医师切取标本后，应尽快将标本置于 10%

2、福 尔马林液内固定，固定液量为 45倍于标本体积，也可达到 1520 倍。对较大的标本应切开固定，切开厚度为 1 cm 左右，为保存 标本的原有大体形态， 切开时最好不要完全断开。 固定时间应视 标本大小而定，小标本应不少于 4 h ，大标本应不少于 8 h 。取 材组织面积为2 cmx 1.5 cm ,厚度不超过0.3 cm，骨组织或钙 化组织需先经 10%硝酸水溶液脱钙至针刺入无阻力感后再取材。2.2脱水 标本放入全封闭式组织处理机后，AAF固定液1h 80%酒精 30 min 90%酒精 30 min 95%酒精 I 1 h 95%酒精 1 h 无水乙醇I 1 h 无水乙醇H 1 h 无

3、水乙醇山1.5 h 二 甲苯 I 30 min 二甲苯口 1 h 石蜡 I 30 min 石蜡 30 min 石蜡山1 h 石蜡W 1.5 h。2.3包埋 将脱水后的组织按不同要求用石蜡(58 C60C) 进行包埋。2.4 切片 将冷却的蜡块放于切片机上切片， 厚度一般为 34 a m。2.5 染色 石蜡切片脱蜡至水放入苏木素工作液内染色15 min 自来水洗1 min 1%盐酸酒精分化 10 s 自来水洗1 min稀氨水(1%)反蓝20 s 自来水洗1 min 95%酒精 10 s 乙醇性伊红液 13 min 85%酒精 1 min 90%酒精 1 min 95%酒 精I 1 min 95%

4、g 精口 1 min 100%g 精I 1 min 100%S 精口 1 min二甲苯透明，电风筒吹干后，用中性树胶封片。3 结果组织固定、脱水效果好，易于连续制薄片，HE染色胞浆分明。4 讨论准确的病理诊断离不开好的石蜡制片， 制作出好的石蜡切片 需要我们每个步骤的正确与认真。 临床医生切取标本后， 应尽快 将标本置于盛有足够固定液的容器内， 固定液量一般为 45倍于 标本体积，也可达到 1520 倍 1。大标本及有包膜的标本要 切开固定，切开间距为1 cm,切开时不应完全断开，应保存标 本原有的大体形态。 固定时间应视标本大小而定， 小标本不少于 4 h ，大标本则不少于 8 h ，尽可能

5、的避免出现因固定不及时或 不充分导致标本干涸或腐败而无法制片。取材时组织面积为 2 cmx 1.5 cm，厚度不超过0.3 cm，组织太大或过厚时均可降低 脱水效果，骨组织或钙化组织需先经 10%硝酸水溶液脱钙至针刺 入无阻力感后再取材。 为达到最佳脱水效果， 脱水机内的试剂要 经常更换。我科经多年实际操作对比总结，组织块达到 500700 块时更换AAF固定液；组织块3500块左右时更换两道100%酉精 和两道石蜡（即只更换前面A缸、B缸蜡，同时把原来没有更换 的C缸、D缸石蜡重新设定为 A缸和B缸，把新更换的石蜡再设 定为C缸和D缸）；组织块达到7000块左右时将所有试剂更换 2。如此操作

6、时既能保证组织达到最佳脱水效果，而且能延 长脱水机内试剂使用周期， 降低了成本。 组织包埋时石蜡温度应 与组织温度相接， 不然会引起组织与周围石蜡脱裂， 影响制片质 量 3。包埋时镊子温度亦应与组织温度接近，否则会黏附组 织，造成相互污染。包埋面要平，特别是碎小组织要聚集平铺， 这样才能保证留片时切全组织。 使用轮转式切片机切片时， 应先 将蜡块冷却，使刀刃与蜡块表面呈 5°夹角，一般切片厚度为 34 卩m,切片时应修出标本至最大面暴露后再留片，小标本不要修 太多，大标本应切全。修蜡块与留组织片时不要在同一个刀位，在一边修好蜡块后移到另一边留片。 使用新刀切片时应尽量先切 小组织或淋

7、巴结等实性组织，再切脂肪、肌肉等组织，最后切骨 组织及钙化等较硬组织。 用轮转式切片机切片时应将组织硬脆难 切的部分放在上端 （ 如皮肤组织应将表皮部分向上，而胃肠等组 织应将浆膜面朝上 ） ，这样既可以省刀又能保证切片质量。留片 时脂肪组织因内充满脂肪滴， 不易被脱水剂完全溶解， 石蜡也不 能完全浸透， 切片时修至最大面后， 用冰块贴到蜡块上冰 510 s 后再立即切片， 低温可暂时使未脱透的脂肪滴凝固， 这样就可以 切出较完整的组织片，切片厚度可调整为56卩m 4。凝血块经脱水后组织较干脆， 切片时易成碎末不完整， 因此切片前可 用拇指沾温水在组织最大面上捂几秒钟再切片。 脑组织切片时容

8、易粘刀皱褶不易打开， 可以在切片前将其冷冻时间延长一些， 展 完片时要靠在烤片机边上，控水后再烤片，否则容易产生气泡。 切出的蜡片正面向上放入 30%酒精中进行初步展片后再入展片箱 二次展片，一般展片箱水温为低于蜡熔点的10C12C。裱片速度要快，时间过长组织内细胞易散裂开。切好的蜡片在60C烤箱内烤 30 min 即可脱蜡染色。使用二甲苯脱蜡时应彻底，组织 脱蜡不干净时，HE染色或组织不易上色或上色后胞浆混浊，颜 色发灰。脱蜡好坏主要取决于二甲苯的新旧、温度和时间，温度 越高脱蜡速度越快且干净，但二甲苯为有毒、易挥发液体，加温 同时亦加速其挥发。 为达到最佳脱蜡效果， 我们科经多次摸索总 结

9、，将二甲苯后的一道无水酒精放在 60C温箱里预热，由于此道无水酒精内含有少量二甲苯， 加温后能快速彻底地把石蜡脱干 净且避免了二甲苯加温挥发对病理工作者的伤害。 石蜡切片脱蜡 后进行HE染色，传统的HE染色方法5为:苏木素染色5 min- 自来水洗1 min 19盐酸酒精分化 20 s 自来水洗1 min 稀氨 水（1%）反蓝30 s 自来水洗1 min 水溶性伊红染色 30 s 自 来水洗30 s 85%酒精脱水 20 s 90%酒精30 s 95%酒精I 1 min95%酒精 H 1 min 100%酒精 I 2 min 100%酒精 H 2 min 二甲苯I 2 min 二甲苯H 2 m

10、in 二甲苯山2 min 中性树胶封 片，其中伊红染液有两种配制方法，一种为水溶性伊红（伊红 Y0.51 g,蒸馏水100 ml）,另一种为乙醇性伊红（伊红Y 0.51 g, 90%酒精100 ml）。刚开始时本科在传统 HE染色方法中选用了水 溶性伊红进行细胞浆等染色， 发现切片在伊红液中无论上色有多 深，经过快速水洗后组织内伊红褪色严重，且上色极不均匀。之 后我们科改用了乙醇性伊红且染色后不经水洗， 此方法虽然克服 了水溶性伊红水洗后褪色明显的问题，但因其染色前经过水洗， 仍会有少量水份带入伊红液内使其不断被稀释， 因此， 为了达到 最佳染色效果只能不断地更换伊红液， 增加了制片成本。 为了减 少试剂的浪费， 本科在此方法上进行了多次摸索， 最终