急慢性应激对大鼠中枢神经肽Y腺苷酸环化酶表达的影响

1、急慢性应激对大鼠中枢神经肽Y腺苷酸环化酶表达的影响     【摘要】  目的 探讨急、慢性应激对大鼠行为及不同脑区神经肽Y、腺苷酸环化酶表达的影响。 方法 将30只雄性SD大鼠随机分为急性应激组、慢性应激组和正常对照组，每组10只，用强迫游泳和空瓶刺激分别制作急性和慢性应激模型，采用开野实验箱观察各组大鼠进入中央格次数、停留时间、外周格子数、修饰次数、粪便粒数；采用免疫组织化学方法检测各组大鼠神经肽Y、腺苷酸环化酶在前额叶皮质，海马CA3区，纹状体的表达水平，并进行相关分析。 结果 开野实验箱中观察各组大鼠行为学指标显示，三组进入中央格次数、停

2、留时间、外周格子数及修饰次数比较均有显著性差异（F=2.31、2.76、4.20、4.37，P0.010.05）。神经肽Y表达水平急、慢性应激组在前额叶皮质、纹状体均显著高于正常对照组（F=7.37、4.60，P0.01），在海马CA3区慢性应激组表达水平显著高于正常对照组（P0.05），而急性应激组无显著性变化。腺苷酸环化酶在慢性应激组大鼠的前额叶皮质，海马CA3，纹状体的表达水平显著低于正常对照组（P0.05），而急性应激组大鼠在纹状体表达有所增加（P0.05）。急性应激组大鼠前额叶皮质，纹状体腺苷酸环化酶的表达和该组大鼠在开野实验箱中的停留时间，修饰次数成显著正相关（r=0.944、0.

3、944、0.868、0.783）。 结论 强迫游泳和空瓶应激可诱导大鼠情绪障碍，神经肽Y、腺苷酸环化酶与情绪有关，前额叶皮质、纹状体腺苷酸环化酶的表达在急性应激状态的生理改变中有重要作用。 【关键词】  应激；前额叶皮质；海马；纹状体；神经肽Y；腺苷酸环化酶【Abstract】 Objective  To explore the effects of acute and chronic stress on behavior and expression of neuropeptide Y and adenylcyclase in rats different encepha

4、lic region. Mehtods  Thirty male SpragueDawley rats were randomly divided into acute stress,chronic stress and control group(each n=10)，acute and chronic stress models were made with forced swimming and empty bottle stimulation separately，and frequency of getting into central grille, detention

5、time , outer grille numbers,modifying numbers and dejecture grain number were observed with openfield experimental box;expressions of neuropeptide Y and adenylcyclase in prefrontal lobe cortex, hippocampus CA3，striatum of the groups were observed using the immunohistochemistry method and correlation

6、 analyses conducted. Results  There were significant differences in frequency of getting into central grille, detention time , outer grille numbers,modifying numbers among the 3 groups(P<0.010.05).Expression levels of neuropeptide Y in prefrontal lobe cortex and striatum were markedly higher

7、 in both acute and chronic and in hippocampus CA3  in  the chronic than in the control group(P<0.01,P<0.05) .Expressions of adenylcyclase in prefrontal lobe cortex，hippocampus CA3 and striatum were significantly lower in the chronic than in the control group(P<0.05) and those in s

8、triatum in the acute group increased(P<0.05). Expressions of adenylcyclase in prefrontal lobe cortex and striatum were significantly positively related to detention time and modifying numbers in the acute group. Conclusion  Forced swimming and empty bottle stimulation could induce rats emoti

9、onal disorder, neuropeptide and adenylcyclase are  related to emotion and expressions of adenylcyclase in prefrontal lobe cortex and striatum has an important role in physiochanges in acute stress state.  【Keywords】 Stress；prefrontal lobe cortex；hippocampus；striatum；neuropeptide Y；ade

10、nylcyclase    塞里认为，每一种疾病或有害刺激都有相同的、特征性的和涉及全身的生理生化反应过程，将其称作一般适应综合症1。神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）是中枢神经系统最丰富的肽类，中枢NPY与癫痫、睡眠、肥胖、学习和记忆、胃肠的调整、酗酒、焦虑、抑郁的许多生理过程有关2。NPY作为有效的神经递质至少通过5个G蛋白偶联受体发挥生物学作用3。中枢NPY主要是作为抗焦虑的神经递质4。腺苷酸环化酶(Adenylcyclase，AC)分布广泛，主要位于细胞质膜上。G蛋白的多种活化受体与AC之间起偶联作用。然而随着研究的进一步深入，有学者提出在应

11、激的基础上Ca2+刺激的AC与神经元的功能变化有很强的相关性5。有研究认为6，AC激动剂Forskolin作用于蛋白激酶A通路产生浓度依赖的交感神经元NPY分泌的持续刺激。许多学者依据临床上抑郁症患者用药起效的滞后性认为抑郁症发病机制与AC信号传导系统密切相关。由于前额叶皮质、海马和纹状体在应激反应中是最有可能参与的脑区，因此，研究应激反应中NPY、AC在这些脑区的表达及其表达水平与不同应激所致动物的行为学变化的相关性，对于我们理解情绪障碍的病理生理过程有重要意义。1 材料与方法1.1 实验动物 雄性SD(SpragueDawley，SD)大鼠许可证号SCXK(豫)200500013

12、0只，体重230 g270 ，购自河南省试验动物中心。适应性群养1 w。9：0011：00·d-1用手抚摸大鼠背部，每只大鼠平均抚摸3 min。饲养期间通风良好，环境安静，温度适宜，自然光照，自由进食水。按体重随机分为正常对照组、急性应激组和慢性应激组，每组10只。1.2 方法1.2.1 应激模型的建立  （1）急性应激组：急性应激组开始混合饲养，于造模最后1 d做强迫游泳，参照马文涛等7急性应激模型，在9：0012：00于水深30 cm，水温恒定在25 的水桶中强迫大鼠游泳30 min。游泳后用烘干机把大鼠哄干，30 min后开始做开野实验观察。（2）慢性应激组

13、：根据文献8采用空瓶应激情绪模型，大鼠单笼饲养，第1 w，每天900910，21002110，在这两个时间段让大鼠自由饮水，其余时间不给水；第2 w3 w，在上述两个时间段随机给予大鼠空瓶刺激和自由饮水各1次，其余时间不给水。实验过程共3 w，在整个实验过程中大鼠自由进食。（3）正常对照组，不进行任何处理，均分到两个笼中混合饲养。1.2.2 行为学观察 自制100cm×100cm×50 cm的木质开野实验箱9，箱底用白线平分为25个20cm×20cm的方格，靠箱边的16个方格为边缘格，中央9个为中央格。SD大鼠行为观察时先将SD大鼠放在正中央的格子，观察

14、大鼠在箱内5 min的行为情况。观察指标包括：（1）中央格进入次数：三爪以上跨入中央格的次数，第1次出中央格后开始记数。（2）中央格停留时间。（3）边缘格爬行的格子数。（4）修饰次数：舔食体毛，前爪竖起或者抓挠面部。（5）粪便粒数。每只大鼠实验之前先清扫箱底，每次由2人同时观察，将平均得分用于统计分析。实验室环境要求安静，光线要暗，动物抓取过程中要轻拿轻放。1.3 主要仪器和试剂1.3.1 主要仪器 Leica CM1800型冰冻切片机、PIAS2000显微图像定量分析系统、Nikon E4500照相机、Nikon Y1Dp显微镜。1.3.2 主要试剂  （1）A

15、C：A cyclase 1(H70)兔多克隆IgG（一抗），美国SANTA CRUZ公司生产；与A cyclase 1(H70)配套试剂盒有兔Sp检测试剂盒（包括3%H2O2去离子水，封闭用正常山羊血清工作液，生物素化山羊抗兔二抗工作液，辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液），购自北京中杉金桥生物技术有限公司。（2）NPY：兔抗NPY Cat.nr.PS227 IgG（一抗），由Monosam公司生产，与之配套的试剂盒：AntiRabbit，HRP/DAB(ReadyToUse)Ultravision Detection System.由labvision公司生产，购自深圳晶美生物技术有限公司。

16、1.4 取材和切片 各组大鼠均给予10%水合氯醛（0.5 ml·100 g）腹腔麻醉，沿胸骨柄左缘打开胸腔，输液针头刺入左心室心尖部，并用血管嵌固定，快速灌注100 ml生理盐水，剪开右心房静脉窦待流出液体变清后再快速滴入4%多聚甲醛PB溶液200 ml，持续时间大约15 min，然后断头取脑10，脑块修整后置于4%多聚甲醛PB溶液的棕色广口玻璃瓶中避光4 条件下后固定4 h，然后再将固定好的大脑分组放入装有20%蔗糖PBS溶液的棕色广口玻璃瓶中，组织沉底后待用。在冰冻切片机冷箱中用OCT包埋剂包埋固定，连续矢状位切片，片厚5 m，用涂有APES粘片剂的载玻片粘片。1.5

17、免疫组织化学检测 （1）免疫组织化学染色过程：PBS溶液泡洗3%H2O2孵育PBS溶液泡洗滴加封闭血清相应浓度一抗PBS溶液泡洗生物素化二抗PBS溶液泡洗辣根过氧化物酶标记链霉白素工作液PBS溶液泡洗DAB显色脱水透明和中性树胶封片。（2）图像分析:通过显微镜找出每组大鼠切片中前额叶皮质（FC），海马CA3区，纹状体区域分别照相，以上各部位均用20倍物镜取三个连续视野拍照求均值以代表此样本。阳性颗粒分析结果用积分光密度来表示，细胞质或细胞膜中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达细胞，无阳性反应为阴性。1.6 统计方法 所有数据采用SPSS12.0统计软件处理。并进行单因素方差分析

18、、最小显著差法和相关分析。P0.05显示有统计学意义。2 结果2.1 开野实验箱中三组大鼠的行为学变化比较，见表1。表1  三组大鼠的行为学变化(略)注：与正常对照组比较P0.05，P0.01；与急性应激组比较*P0.05。        表1显示，开野实验箱中观察大鼠各行为学指标发现，三组进入中央格次数、停留时间、外周格子数及修饰次数比较均有显著性差异（F=2.31、2.76、4.20、4.37，P0.010.05）。急性应激组进入中央格次数、停留时间、外周格子数、均显著低于正常对照组（P0.010.05）；慢性应激组大鼠进入中央格次数、停留时间均显著高于急性应激组、低于正常对照组（P0.05），进入外周格子数、修饰次数均显著高于急性应激组（P0.010.05）。2.2 三组大鼠不同脑区NPY的表达水平比较，见表2。