转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证

1、转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证一、农杆菌介导的棉花胚胎再生遗传转化体系（一）实验方法以W0为受体，将pC2-dsGFP、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH3、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP载体的农杆菌菌株，运用农杆菌介导法分别将目的基因转入棉花下胚轴，通过组织培养技术获得转基因再生株系。嫁接试验采用根系发达抗病性强的海岛棉（海7124）的实生苗做砧木，接穗是转化基因再生植株。（二）实验步骤农杆菌介导的棉花遗传转化分3步，转化、胚胎发生和植株再生。1） 种子脱绒：轧花后的棉花种子，烘干（40左右），用适当硫酸（H2SO4）脱去短绒，自来水洗掉种子表面浓硫酸，充分晾干；

2、2） 种子的消毒处理：选取饱满棉花种子于无菌三角瓶中，无菌水冲洗一次，70%乙醇表面消毒种子30 Sec，弃去乙醇，加入30%过氧化氢（H2O2）于摇床振荡2-3 h，弃掉H2O2，无菌水冲洗种子3-5 次，保留少量无菌水浸过种子，存放28，18-24 h，待到种子破壳露白；3） 外植体制备：在无菌条件下，滤掉消毒过种子的无菌水，剥去种子种壳，接种于苗培养基（1/2MS）上， 28 黑暗培养（N）3 d，然后在28、3000-5000 Lx光照下培养 (D/N16 h/8 h) 3 d。4） 农杆菌活化与浸染液制备：将-70保存的农杆菌载体菌株，取出冻融。在固体LB平板培养基上（含Kan 50

3、g/mlRif/Str 50g/ml）划线，28静止培养1-2天。平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体（Kan 50g/mlRif/Str 50g/ml）培养基（10ml）中，28振荡过夜，再按1%接种量转接入50mL新鲜培养基中（含Kan 50g/mlRif/Str 50g/ml）培养8小时左右，测定OD600为0.5左右。4，5000rpm离心5min ，收集菌体。然后用5mLMSB0（含100 uM/ml AS）液体培养基重新悬浮沉淀，再转入15-45mL的 MSB0（含100uM AS）液体培养基，28摇床上培养至OD600为0.5左右，稀释培养液OD600 值0.3-0.7

4、时备用。5） 浸染与共培养：在超净台上使用手术刀切割茎段7cm左右，将下胚轴茎段浸泡于农杆菌侵染液中5-8 min，用灭菌滤纸吸干胚轴段菌液，放在铺有一层灭菌滤纸的共培养培养基上，用封口膜封口，2225共培养2d。6） 下胚轴切段两端切口长出的愈伤组织直径大约0.5-1.0 cm时切下来单独继代，愈伤组织块的直径大约2 cm时转移到胚性愈伤组织诱导培养基上。7） 转化组织从1个或几个细胞开始分裂，3-4个月即有蚕豆大小（直径2 cm左右）。8） 愈伤在MSB上长到直径2cm左右，接种到MSB2诱导胚性愈伤，在MSB2上继代1-3次即会有胚性愈伤的出现。9） 待愈伤组织长到直径约2-3cm 时，

5、将其从胚轴段切除，愈伤组织块转入相同的培养基增殖，可以有效的去除农杆菌和防止愈伤组织褐化现象。10） 当愈伤组织块直径达到7-8 mm 放入胚性愈伤诱导培养基中，在培养间常规条件下培养，每隔一个月左右转一次相同的培养基，2-6 次，到出现黄绿色或灰绿色，米粒状的胚性愈伤为止。11） 只要疑似分化就挑出来少许，分散继代到分化培养基上，在分化培养基上能生存的一般是胚性愈伤组织，而非胚性愈伤在分化培养基大多不能存活。12） 由胚性愈伤再生植株经历体细胞胚的形成、成熟、萌发和小植株的生长。经过10天左右的抗性胚筛选，将成活的胚性愈伤挑到瓶口包棉塞、使用透气瓶塞培养瓶里培养，促进胚状体的形成和萌发。13

6、） 将萌发的小植株平铺接种到铺滤纸的培养基上，诱导成苗。小植株再转入大的三角瓶中（培养基同愈伤组织增值配方），无菌条件下取小植株23 片叶，小量法提取DNA，进行标记基因和目的基因的PCR 扩增，将阳性小植株嫁接温室。14） 在装有营养土的土盆中种上根系发达、抗逆性强的海岛棉或育成品种（抗病、植株旺盛），待棉苗3-5 片真叶时待用（称砧木苗）。用劈接法和插皮接法将转基因再生棉株嫁接到砧木苗上（吴慎杰等，2007）。15） 嫁接后的管理：嫁接后3-4d通气，即旋开瓶盖罩住瓶口2/3，以防接穗发霉，7 d去掉瓶盖，10-12 d揭瓶，15 d左右解绳成活。为了让其快速生长，成活后用霍格兰营养液浇一

7、次。（三）农杆菌介导棉花下胚轴转化利用优化了的陆地棉体细胞再生转化体系，以转化模式品种W0为受体，利用带有目的基因的农杆菌载体菌株EHA105与棉花下胚轴进行共培养后，经过一系列的组织培养再生过程，获得大量的转基因株系。（四）实验结果目前，转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1、 pC2-dsGFP载体转基因抗虫棉获得再生植株的情况如下，后续实验还在进行中。pC2-dsPTTH3 ：已获得20个克隆，10个克隆已嫁接成苗，有2个克隆已经拿到T1代种子。pC2-dsPTTH5 ：已获得30个克隆，有25个克隆已出大量小苗，20个左右克隆已

8、嫁接，其中几个克隆已结铃。pC2-dsJHAMT ：已获得61个克隆，35个克隆已出大量小苗，嫁接20个克隆，还有小苗待嫁接。pC2-dsJHBP1：已获得15个克隆，12个克隆嫁接，有2个克隆已经拿到T1代种子，已南繁。pC2-dsGFP ：已获得5个克隆，其中3个克隆均嫁接成活，收到T0代种子。1. pC2-dsPTTH32. pC2-dsJHAMT3. pC2-dsPTTH54. pC2-dsJHBP15. pC2-dsGFP二pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1转基因株系的分子检测结果用CTAB法提取转基因株系叶片的基因组DNA

9、，以目的基因的特异性引物进行PCR扩增。结果如下：（注：各载体获得的转基因后代株系，具体实验还在进行中，后续将获得更多克隆数，并进一步进行分子检测。所以，现获得检测结果没有具体统计。）（一）pC2-dsPTTH3 T0代验证： 1为marker；2为阳性对照；5为加水阴性对照； 3、4、6、7、8、9、10、11分别为转基因不同株系（二）pC2-dsPTTH5 T0代验证：1为marker；2为阳性对照；3为水阴性对照； 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16分别为转基因不同株系（三）pC2-dsJHAMTT0代验证：1为marker；2为阳性对照；3为加水阴性对照；

10、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18分别为转基因不同株系（四）pC2-dsJHBP1T0代验证：1为marker；2为阳性对照；13为加水阴性对照； 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、分别为转基因不同株系 T1代验证:1为marker；2为阳性对照；12为加水阴性对照；3、 4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18分别为转基因不同株系 （五）pC2-dsGFPT0代验证：1为marker；2为阳性对照；8为加水阴性对照； 3、4、5、6、7分别为转基因不同株系三、转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT

11、、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1载体转基因棉花抗虫遗传性分析（一）转不同世代pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉材料的抗性分离情况：本实验将依据抗虫转化植株筛选和生物鉴定的结果，并根据田间生长情况和种子成熟状况，选择部分转化材料进行南繁，对其T2代(T1代自交获得T2代)、T3代(对T2代中的部分抗虫单株自交获得T3代)材料的抗虫性分离情况进行遗传分析。（二）转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉不同发育时期抗虫性分析本实验将以转基因抗虫棉为实

12、验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。将分别于棉花苗期、蕾期和铃期取各种试验材料倒3位或倒4位展开叶，接棉铃虫初孵幼虫进行室内抗虫性生物检测。每材料接15管，每管接棉铃虫幼虫5头，重复3次。调查72h幼虫死亡率及叶片受害面积。（三）转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉相同时期不同器官的抗虫性分析本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。于棉花生长花铃期分别取其棉叶、棉蕾、花瓣、(未成熟)棉桃等组织器官材料进行

13、棉铃虫饲喂试验。不同组织器官(材料)均接虫30管，每管接入棉铃虫幼虫1头，重复取样3次。调查72小时幼虫死亡情况。（四）不同龄期棉铃虫幼虫对转基因抗虫棉的敏感性分析 本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。于棉花生长蕾期分别取其倒3叶或倒4叶，并分别接入1龄、3龄、5龄棉铃虫幼虫进行抗虫棉抗性鉴定研究。每组试验安排30管，每管接入幼虫1头，设3次重复。调查72小时幼虫死亡情况及叶片受害面积（五）转基因抗虫棉对不同世代棉铃虫的敏感性分析本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫

14、棉为阳性对照进行试验。在第2代、第3代、第4代棉铃虫发生期间，分别以棉花叶片和棉蕾为试验材料进行抗虫性分析研究。每处理为15个样管，每样管接入棉铃虫3龄幼虫l头，设3次重复。调查72小时幼虫死亡情况。（六）环境条件对转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉抗性的影响本实验将以我国三大棉区以及沿海植棉区的某些特定或易变气候、环境条件，设计温度变化(突然升高、突然降低)、干早和水浸、盐碱等不同试验处理，以了解转基因抗虫棉对环境条件的敏感性。以转基因抗虫棉为实验材料，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。（1）温度处理试验

15、在温室内用花盆种植，温度的突然上升和突然下降处理在人工气候箱内进行。试验以正常温室条件下生长的棉花幼苗为环境对照处理，设20、30、35、45恒温处理以及由20突然上升到30、35、40，稳定24小时;30突然上升到35、45，稳定24小时:45突然下降到35、30、20，稳定24小时;35突然下降到30、20，稳定24小时等不同处理。各处理光照强度、光照时间均保持一致。每材料接15管，每管接棉铃虫初孵幼虫5头，重复3次。调查72小时幼虫死亡情况。（2）干早处理试验在温室内用花盆种植。试验以正常条件下生长的棉花幼苗为环境对照处理，设水浸48小时、干旱(不浇水)72小时(3天)、120小时(5天)、168小时(7天)、216小时(9天)以及至叶片半萎蔫等几个不同处理。每材料接15管，每管接棉铃虫幼虫5头，重复3次。调查72小时幼虫死亡情况。（3）盐碱处理试验在温室内用花