第十三章__细胞衰老与凋亡10

1、第十三章第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡与细胞衰老第十三章第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡程序性细胞死亡细胞衰老细胞衰老 细胞的死亡是个体的死亡，对于多细胞生物而言，细胞细胞的死亡是个体的死亡，对于多细胞生物而言，细胞的死亡并不意味着个体生命的终结；相反，细胞死亡是维持的死亡并不意味着个体生命的终结；相反，细胞死亡是维持个体的正常生长发育及其生命活动所必需的，其重要性不亚个体的正常生长发育及其生命活动所必需的，其重要性不亚于细胞的增殖。于细胞的增殖。细胞的衰老，即复制衰老，指体外培养的正常细胞经过细胞的衰老，即复制衰老，指体外培养的正常细

2、胞经过有限次数的分裂后，停止分裂，细胞形态和生理代谢活动发有限次数的分裂后，停止分裂，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。生显著改变的现象。个体的衰老（个体的衰老（aging）是指随着年龄的增加，机体功能）是指随着年龄的增加，机体功能呈现退行性变化，并但随着生殖能力的下降和死亡率上升的呈现退行性变化，并但随着生殖能力的下降和死亡率上升的现象。现象。第一节第一节 程序性细胞死亡程序性细胞死亡动物细胞的程序性死亡动物细胞的程序性死亡 死亡方式：死亡方式： 凋亡（凋亡（apoptosis） 坏死（坏死（necrosis） 自噬（自噬（autophagy）植物细胞的程序性死亡植物细胞的程序性死亡

3、酵母细胞的程序性死亡酵母细胞的程序性死亡蝌蚪尾的消失蝌蚪尾的消失脊椎动物的神经系统的发育脊椎动物的神经系统的发育发育过程中手和足的成形过程发育过程中手和足的成形过程概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（programmed cell death, PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰

4、方面都起着非自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用常关键的作用细胞凋亡的形态学、生化特征细胞凋亡的形态学、生化特征细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的分子机制细胞凋亡的分子机制动物细胞的程序性死亡动物细胞的程序性死亡细胞凋亡的形态学特征：细胞凋亡的形态学特征：凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月

5、形帽状结构等形态，沿着膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布核膜分布凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体。逐渐形成单个的凋亡小体。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化胞凋亡的生化特征胞凋亡的生化特征细胞凋亡的主要特征是形成大小为细胞凋亡的主要特征是形成大小为180200bp特征性

6、的特征性的DNA ladders组织转谷氨酰胺酶组织转谷氨酰胺酶tTG（tissue Transglutaminase）积累并达到较高水平）积累并达到较高水平细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：电泳：DNA片段就呈现出梯状条带片段就呈现出梯状条带TUNEL测定法，即末端脱氧核苷酸酶移换酶介导的测定法，即末端脱氧核苷酸酶移换酶介导的dUTP缺口末端标记测定法。缺口末端标记测定法。彗星电泳法（彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析流式细胞分析 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察

7、形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察 台盼兰：活细胞台盼兰：活细胞 DAPI，Giemsa：结合：结合DNA染色质异固缩、凋亡小体的形成、细胞发泡染色质异固缩、凋亡小体的形成、细胞发泡细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测DNA电泳电泳：DNA片段就呈现出梯状条带片段就呈现出梯状条带 细胞凋亡的主要特征是形成大小为细胞凋亡的主要特征是形成大小为180200bp特征性的特征性的DNA ladders细胞色素细胞色素c诱导的凋亡细胞诱导的凋亡细胞DNA电泳图电泳图1细胞色素细胞色素c诱导诱导0 h2细胞色素细胞色素c诱导诱导1 h3细胞色素细胞色素c诱导诱导2 h4细胞色素细胞色素c诱导诱导3 h5细胞色

8、素细胞色素c诱导诱导4 h6阴性对照阴性对照7Marker （ 自赵允、翟中和）自赵允、翟中和）细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测TUNEL测定法（测定法（DNA断裂的原位末端标记法，末端断裂的原位末端标记法，末端脱氧核苷酸酶移换酶介导的脱氧核苷酸酶移换酶介导的dUTP缺口末端标记测定法）缺口末端标记测定法）彗星电泳法（彗星电泳法（comet assay）：将单个细胞悬浮于琼脂）：将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色。泳，并用荧光染料染色。流式细胞分析流式细胞分析:凋亡细胞凋亡细胞DNA发生断裂和丢失

9、，呈亚发生断裂和丢失，呈亚二倍体状态。二倍体状态。诱导细胞凋亡的因子诱导细胞凋亡的因子Caspase家族与凋亡：家族与凋亡： Caspase依赖性的细胞凋亡依赖性的细胞凋亡 由死亡受体起始的外源途径由死亡受体起始的外源途径：配体是肿瘤坏死因子（：配体是肿瘤坏死因子（TNF）家族成员家族成员 由线粒体起始的内源途径：细胞色素由线粒体起始的内源途径：细胞色素c的释放，线粒体外的释放，线粒体外膜通透性的改变受膜通透性的改变受BCL-2 家族家族的调控的调控 Caspase非依赖性的细胞凋亡非依赖性的细胞凋亡 凋亡诱导因子（凋亡诱导因子（AIF） 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶Gp53与细胞凋亡与细

10、胞凋亡三、细胞凋亡的分子机制三、细胞凋亡的分子机制细胞凋亡与坏死细胞凋亡与坏死二者的主要区别：二者的主要区别：细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies），凋亡小体则），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。在细胞

11、坏死时，细胞质出现空泡，细胞质膜破损，细胞内容物，包在细胞坏死时，细胞质出现空泡，细胞质膜破损，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段释放到胞外，导致炎症反应。在括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段释放到胞外，导致炎症反应。在细胞坏死过程中染色质不发生凝集，也不产生有规律的细胞坏死过程中染色质不发生凝集，也不产生有规律的200bp的的DNA降降解片段，而是被随即降解，琼脂糖凝胶电泳是呈现弥散性分布，俗称解片段，而是被随即降解，琼脂糖凝胶电泳是呈现弥散性分布，俗称“拖尾拖尾”现象。细胞坏死可能是现象。细胞坏死可能是“程序性死亡的程序性死亡的”的另一种形式，具有的另一种形式，具有包括引发炎

12、症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细包括引发炎症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，坏死作为凋亡的胞必须死亡时，坏死作为凋亡的“替补替补”方式被细胞采用方式被细胞采用. 分裂旺盛的细胞由分裂旺盛的细胞由DNA损伤引发的损伤引发的ATP水平急降会导致水平急降会导致细胞坏死，二分裂迟滞的细胞抵抗细胞坏死，二分裂迟滞的细胞抵抗DNA损伤的能力较强。损伤的能力较强。 DNA损伤损伤NAD+ ADP-核糖核糖PARP细胞质中细胞质中NAD+浓度下降浓度下降 葡萄糖葡萄糖 糖酵解糖酵解 丙酮酸丙酮酸 氧化磷酸化氧化磷酸化氨基酸氨基酸脂肪酸脂肪酸大分子合成大分子合

13、成 氧化磷酸化氧化磷酸化 ATP氨基酸氨基酸脂肪酸脂肪酸大分子合成大分子合成 氧化磷酸化氧化磷酸化 ATP持续增殖细胞持续增殖细胞 非持续增殖细胞非持续增殖细胞 “程序性程序性”坏死坏死 细胞存活细胞存活 DNA修复修复细胞自噬细胞自噬细胞自噬主要发生在个体遭遇营养危机的时候和胚胎发育期间细胞自噬主要发生在个体遭遇营养危机的时候和胚胎发育期间单细胞和单细胞生物均可发生自噬单细胞和单细胞生物均可发生自噬酵母磷脂酰基醇激酶（酵母磷脂酰基醇激酶（PI3K）信号途径）信号途径PI3KAKTTor翻译凋亡自噬ATP细胞外营养物质代谢底物PI3KAKTTor凋亡自噬ATP细胞外营养物质酵母细胞的自噬信号途

14、径植物细胞的程序性死亡植物细胞的程序性死亡植物细胞的过敏（植物细胞的过敏（HR）反应）反应木质部管状细胞的成熟过程木质部管状细胞的成熟过程酵母细胞的程序性死亡酵母细胞的程序性死亡 1997，发现酵母突变株，发现酵母突变株cdc48具有程序性死亡现象具有程序性死亡现象 低浓度的双氧水或醋酸、较高浓度的盐或糖、植低浓度的双氧水或醋酸、较高浓度的盐或糖、植物抗真菌多肽等能诱导酵母发生细胞程序性死亡物抗真菌多肽等能诱导酵母发生细胞程序性死亡第二节第二节 细胞衰老细胞衰老(cellular aging或或cell senescence)Hayflick界限界限(Hayflick Limitation）细

15、胞在体内条件下的衰老细胞在体内条件下的衰老衰老细胞结构的变化衰老细胞结构的变化细胞衰老的分子机理细胞衰老的分子机理一、一、Hayflick界限界限(Hayflick Limitation)概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。 细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就 是是 Hayflick界限界限 癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态癌细胞或培养的细胞系是不

16、正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞已经不同于原先的细胞 细胞的增殖能力与供体年龄有关细胞的增殖能力与供体年龄有关 物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系 (龟龟175岁岁/90125次次, 小鼠小鼠3.5年年/1428次次)二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境 是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老三、衰老细胞结构的变化三、衰老细胞结构的变化细胞核的变化细胞核的变化:体外培养的二倍

17、体细胞，细胞核随着细胞分裂体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大次数的增加不断增大;核膜内折、染色质固缩化核膜内折、染色质固缩化内质网的变化内质网的变化: 衰老衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，糙面内质网的总量似乎是减少了质中，糙面内质网的总量似乎是减少了线粒体的变化线粒体的变化: 通常通常细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大积则随龄增大.致密体的生成致密体的生成:褐脂质、老年色素、血褐质、脂色素、残体。褐脂质、老年色素、血褐质、脂色素、残体。膜系统的变化膜系统的变化: :膜流动性降低、

18、韧性减小；衰老细胞间间隙连膜流动性降低、韧性减小；衰老细胞间间隙连接接 ;细胞细胞膜内（膜内（P面）颗粒的分布也发生变化面）颗粒的分布也发生变化 .细胞衰老的生物学特征：细胞衰老的生物学特征： 1.细胞生长停滞，分裂停止细胞生长停滞，分裂停止2.衰老相关的衰老相关的-半乳糖苷酶（溶酶体半乳糖苷酶（溶酶体内的水解酶）活化内的水解酶）活化四、细胞衰老的分子机理四、细胞衰老的分子机理端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的的“有丝分裂钟有丝分裂钟”学说（学说（Harley,1990Harley,1990）氧化性损伤

19、学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS-OROS-O2 2- -，OHOH- -，H H2 2O O2 2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。 rDNArDNA与衰老与衰老: : 酵母染色体外酵母染色体外rDNA rDNA 环（环（ERCERC）的积累，导致细胞衰老。）的积累，导致细胞衰老。 沉默信息调节蛋白复合物（沉默信息调节蛋白复合物（Sir complexSir complex）与衰老：）与衰老：Sir complex Sir complex 存在存在于异染色质区，其作用在于阻断所在

20、位点于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNADNA转录。转录。 SGS1SGS1基因和基因和WRNWRN基因与衰老：基因与衰老： SGS1SGS1基因和基因和WRNWRN基因同源基因同源, ,编码解旋酶编码解旋酶; ; 酵母酵母sgs1sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均突变体寿命明显短于野生型（平均9.59.5代代:24.5:24.5代）代）; ; wrnwrn突变突变 引发早老症引发早老症. . 发育程序与衰老发育程序与衰老: : 线粒体线粒体DNADNA与衰老与衰老: Sen-DNA(80: Sen-DNA(80年代年代);mtDNA);mtDNA突变积累与细胞衰老有关突变积累与细胞

21、衰老有关. .细胞来源细胞来源人胚肺成纤人胚肺成纤维细胞维细胞中年人成中年人成纤维细胞纤维细胞老年人成老年人成纤维细胞纤维细胞可增殖可增殖代数代数 40-60 20 2-4不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数二、细胞在体内条件下的衰老二、细胞在体内条件下的衰老在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生体发育的早期也会发生;衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长期明显延长;衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老衰

22、老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老;骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢速度也趋缓慢.Caspase家族家族线虫线虫(C.elegans)凋亡研究发现凋亡研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。的激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类同哺乳类同源物是白介素源物是白介素-1转换酶转换酶ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即即Caspase1。 Caspase活性位点是半胱氨酸活性位点是半胱氨酸(Cys

23、teine)，裂解靶蛋白位点，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即，即Caspase。现发现的哺乳类动物细胞。现发现的哺乳类动物细胞Caspase家族成员共有家族成员共有15种：种： 白介素前体的活化：白介素前体的活化：Caspase1，4凋亡起始者：凋亡起始者：Caspase2，8，9，10凋亡执行者：凋亡执行者：Caspase3，6，7 Caspase自身以非活化的自身以非活化的Procaspase存在。一般的蛋白酶活化时，存在。一般的蛋白酶活化时，只是将只是将N端

24、的肽段切除，而端的肽段切除，而caspase的活化则需要在两个亚基的连接的活化则需要在两个亚基的连接区的天冬氨酸位点进行切割，结果产生了由两个亚基组成的异二聚区的天冬氨酸位点进行切割，结果产生了由两个亚基组成的异二聚体而活化。体而活化。凋亡过程：激活期和执行期凋亡过程：激活期和执行期激活期激活期 (起始起始Caspase活化活化) :同性活化同性活化,酶元分子聚集成复合物达酶元分子聚集成复合物达到一定浓度时，彼此切割或者构象改变产生有活性的二聚体形式。到一定浓度时，彼此切割或者构象改变产生有活性的二聚体形式。执行期执行期(执行执行Caspase活化活化)： 属异性活化，起始属异性活化，起始Ca

25、spase招募执招募执行行Caspase酶原分子后，对其进行切割，产生具有活性的执行酶原分子后，对其进行切割，产生具有活性的执行Caspase切割细胞内重要的结构和功能蛋白，导致细胞凋亡。切割细胞内重要的结构和功能蛋白，导致细胞凋亡。Caspase家族家族BCL-2家族家族 BCL-2是一种原癌基因，是是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合合BCL-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的家族成员的基因中，常常含有三个保守的BCL-2同源区，即同源区，即BH1，BH2和和BH3。这三个区域

26、。这三个区域是调节凋亡以及蛋白质相互作用所必需的结构。是调节凋亡以及蛋白质相互作用所必需的结构。哺乳动物细胞中发现三种凋亡蛋白酶活化因子：哺乳动物细胞中发现三种凋亡蛋白酶活化因子：Apaf1，Apaf2（ CytC ），），Apaf3。基基因因产产物物 功功 能能 B BC CL L- -2 2 凋凋亡亡抑抑制制剂剂，可可和和 B Ba ax x 及及 B Ba ak k 结结合合 B BC CL L- -x x 其其 L L 型型抑抑制制凋凋亡亡，S S 型型促促进进凋凋亡亡，与与 B Ba ax x 及及 B Ba ak k 结结合合 B BC CL L- -w w 凋凋亡亡抑抑制制剂剂

27、B Ba ax x 凋凋亡亡促促进进剂剂，可可与与 B BC CL L- -2 2，B BC CL L- -X XL L，E EI IB B1 19 9K K 结结合合 B Ba ak k 凋凋亡亡促促进进剂剂，亦亦可可作作抑抑制制剂剂，可可与与 B BC CL L- -2 2，B BC CL L- -X X 和和 E E1 1B B1 19 9K K 结结合合 M MC CL L- -1 1 凋凋亡亡抑抑制制剂剂 B Ba ad d 凋凋亡亡促促进进剂剂，与与 B BC CL L- -2 2 和和 B BC CL L- -X XL L结结合合 C Ce ed d- -9 9 线线虫虫中中的的凋凋亡亡抑抑制制剂剂，B BC CL L- -2 2 同同源源物物 E E1 1B B1 19 9K K 腺腺病病毒毒凋凋亡亡抑抑制制剂剂，与与 B Ba ax x 和和 B Ba ak k 结结合合 BCL-2家族成员家族成员 a 正常正常T细胞杂交瘤细胞细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞凋亡细胞(扫描电镜扫描电镜) c 凋亡细胞凋亡细胞(透射电镜透射电镜)诱导细胞凋亡的因子：诱导细胞凋亡的因子：物理性因子，包括射线（紫外线，物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等），射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等较温和的温