药物的质量研究(综合整理)-20130329

1、药物的质量研究（专业知识）2013.3.29前言：以下内容的参考依据：1、中国药典2005、2010年版二部附录XIXA 药品质量标准分析方法验证指导原则2、化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则3、化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则4、审评中心电子刊物5、以前的工作经验积累等。部分知识点、考察面尚在不断完善中，我们要注意及时关注国家局政策动态，学习新知识，提高研发技术能力。质量研究的一般内容1.性状 2.鉴别3.检查4、含量测定1 性状性状项下有很多内容，外观、色泽、臭、味、结晶性、引湿性等。性状描述要准确，注意对颜色的描述，不能模棱两可。比如某药品标准规定“本品为白色或类白色粉

2、末或结晶性粉末”，结果应根据实际情况写为下面几种情况：（1）本品为白色粉末；（2）本品为类白色粉末；（3）本品为白色结晶性粉末；（4）本品为类白色结晶性粉末。不能直接写为：本品为白色或类白色粉末或结晶性粉末。2 鉴别 常用的方法有化学反应法、色谱法和光谱法等。注意要考察专属性。2.1 化学反应法：主要原理是选择官能团专属的化学反应进行鉴别。包括显色反应、沉淀反应、盐类的离子反应等。2.2 色谱法：主要包括气相（GC）、液相（HPLC）、薄层（TLC）等。2.3 光谱法：红外吸收光谱法（IR）和紫外-可见吸收光谱法（UV）。 3 检查检查项下内容比较多。原料药主要包括一般杂质（氯化物、硫酸盐、重

3、金属、砷盐、炽灼残渣等）、有关物质、残留溶剂、晶型、溶液的澄清度与颜色、干燥失重或水分、比旋光度、异构体等。制剂需进行的检查项目，除应符合相应的制剂通则中的共性规定外，还应根据其特性、工艺及稳定性考察结果，制订其他的检查项目。如口服片剂、胶囊剂一般还应进行溶出度、有关物质等检查；缓控释制剂、肠溶制剂、透皮吸收制剂等应进行释放度检查；小剂量制剂（主药含量低）应进行含量均匀度检查；注射剂应进行pH值、溶液的颜色、不溶性微粒、可见异物、细菌内毒素或热原、无菌、有关物质等检查，注射用粉末还应检查干燥失重或水分等。注：含量均匀度检查，2010版药典有新规定，更加严格：除另有规定外，片剂、硬胶囊剂或注射用

4、无菌粉末，每片（个）标示量不大于25mg 或主药含量不大于每片（个）重量25%者；内容物非均一溶液的软胶囊、单剂量包装的口服混悬液、透皮贴剂、吸入剂和栓剂，均应检查含量均匀度。3.1 有关物质分已知杂质和未知杂质。未知杂质的限度检查，一般情况下采用不加校正因子的主成分自身对照法来进行。对照溶液一般选择1%浓度，有时也会选择2%、5%等浓度，对杂质限度要求低的则可能选择更低浓度，如0.1%、0.2%、0.5%等，以实际品种而定。对于已知杂质的定量检查，要像含量测定一样进行详细的方法学验证（后面详细介绍）。下面介绍一下HPLC法研究的一般流程。3.1.1 色谱条件的确定先进行波谱扫描，确定检测波长

5、。已有国家标准的药品，应先以标准上的方法进行试验，如试验不出，可参考其他文献进行流动相选择试验（通常主峰保留时间610min最佳）。应注明所用色谱柱、流速、柱温、进样体积等信息。3.1.2 耐用性典型的变动因素包括：液相色谱法中流动相的组成、流速和pH值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温等。一般：流动相比例变化±5%、pH变化±0.2、柱温变化±5、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20%以及三根不同色谱柱进行测定。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。3.1.3 系统适用性试验有的项目标准中未明确说明溶液

6、的制备，则直接用供试品溶液；有的项目标准中规定了系统适用性溶液的配制，比如各种条件下的破坏溶液，比如主药与其他物质（包括杂质与非杂质）的混合溶液，考察指标有分离度、理论板数、拖尾因子、保留时间、相对保留时间等。除另有规定外，分离度不得小于1.5；峰高法定量时，拖尾因子应在0.951.05，峰面积法测定时，拖尾因子无明确规定，若拖尾严重，将影响峰面积的积分，应以线性关系合格为判定依据。主峰的理论板数应符合质量标准的规定。3.1.4 专属性试验（1） 空白溶剂（2） 空白辅料（制剂）（3） 破坏试验试验内容：未破坏样品、酸破坏、碱破坏、高温破坏、光照破坏、氧化破坏。制剂应同时做空白辅料的破坏试验，

7、保证辅料不影响主峰的测定。试验时间应长一些，比如标准规定至主成分峰保留时间的3倍，我们试验应至少作到4倍。结论应说明本品主峰与各种破坏条件下产生的降解产物峰分离完全，本法专属性良好。然后说明样品及破坏后的样品在分钟之后无明显杂质峰出现，色谱图记录时间设定为主成分峰保留时间的倍。破坏程度：一般要求主峰降解520%，10%左右是比较理想的。应考察主峰纯度及物料平衡情况（建议列表说明）。关于这一点，下列情况可能会被发补：（1）如果药物在有的破坏条件下都不降解，会被要求加剧破坏条件，如果仍不降解，要求提供合理的解释。（2）如果降解程度过大，会被要求采用缓和的破坏条件重复实验。（3）如果主峰明显降解，检

8、测到的杂质却很低，说明检测方法不合适，会被要求建立专属性强的方法。3.1.5 检测限试验取对照品适量，用溶剂作一系列稀释，按拟定的色谱条件进样，记录色谱图。以信噪比约为3:1或2:1时的进样量为检测限。3.1.6 溶液稳定性试验；一般做0、2、4、6、8h下的溶液稳定性（或更长时间）。按各品种项下规定，取0h下的自身对照溶液作为所有时间点的对照溶液，若不稳定，可做2h内的溶液稳定性（常温或低温，以实际情况而定）。可接受的标准为：主成分的含量变化的绝对值应不大于2.0%，杂质含量的变化在±0.1%以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。溶液不稳定的，须注明“临用新制”。何为"

9、报告限度"？化学药物杂质研究的技术指导原则中有定义，报告限度（Reporting Threshold）：超出此限度的杂质均应在检测报告中报告，并应报告具体的检测数据。原料药的杂质限度最大日剂量：2.0g，0.05%最大日剂量：2.0g，0.03%制剂的杂质限度最大日剂量：1.0g，0.1%最大日剂量：1.0g，0.05%3.1.7 有关物质检查方法的确定研究试验完成之后，确定方法，按药典要求规范用语。供试品溶液如不稳定，应注明“立即精密量取供试品溶液l注入色谱仪”。3.1.8 三批样品有关物质检查按确定的方法对三批样品进行有关物质检查。采用列表形式对自制品和市售品的杂质种类和含量进行

10、比较，必要时采用多种检测手段，如DAD、LC-MS等技术手段逐个进行对比，对自制品与市售品所有杂质进行种类和含量的比较和分析。 关于有关物质的“进样精密度”试验：有人取供试品溶液连续进样来考察，个人认为此法非常不合理，因为“进样精密度”考察的是连续进样时，色谱系统响应值的重复性能，若供试品溶液不稳定，高浓度的供试品溶液在连续进样时，主峰有降解，杂质峰面积增加很明显，无法判定结果。 个人认为以下方法比较合理：如果有关物质检查和含量测定的色谱条件相同，做含量方法学的时候已用对照品溶液或供试品溶液验证过进样精密度，可说明色谱系统的重复性能良好，故有关物质的进样精密度可不做。如果有关物质检查和含量测定

11、的色谱条件不同，或者不管相同不相同，认为有关物质进样精密度均需考察，则应取对照溶液连续进样56次，规定RSD值的限度（此RSD值限度的要求与杂质含量的大小相关）（此法在USP、BP、JP标准中经常见到，可做参考）。上面是有关物质检查的一般流程，杂质定量测定的方法学研究见以下内容。1.准确度该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1%、0.2%和0.3%的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）

12、。 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。备注：一般要求做到平均回收率均在90%-110%之间，RSD不大于5%。2.线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为： 在定量限至一定的浓度范围内配制57份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100%响应值的25%以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。3.进

13、样精密度：取一定浓度的对照品溶液，连续进样5针，杂质峰面积RSD值不大于2.0%。4. 精密度1）重复性配制6份供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。（一般要求做到10%以内）2）中间精密度配制6份供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%（一般要求做到10%以内）。5.专属性已知杂质须先定位，然后可向样品中加入一定量的杂质，考察杂质之间是否可以完全分离。其他内容基本同未知杂质检查一样，做空白试验、破坏试验。可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰须基线分离，

14、除另有规定外，分离度不得小于1.5。5.定量限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。6.耐用性（同前）7.溶液稳定性一般情况下，供试品溶液作8小时内的溶液稳定性试验。8. 杂质对照品储备液溶液稳定性有的杂质对照品非常昂贵，我们想多次使用，那么可以作更长时间的溶液稳定性试验，比如低温冷藏状态下放置7天，于1、2、3、5、7天考察。可接受的标准为：除另有规定外，杂质峰保留时间的RSD值不大于2.0%，峰面积RSD值不大于2.0%，可说明对照品储备液稳定。有关物质的数据要求如杂质含量小于1.0%，则报告的数据应精确到小数点后第二位；如杂质含量大于1.0%，则报告的数据可精确到小数点后第一位。因很

15、多杂质对照品从中检所买不到，经常需要购买进口对照品，成本比较高，故我们可以先用进口对照品进行方法学研究，然后以主成分为参照采用相对保留时间定位，采用加校正因子的主成分自身对照法进行已知杂质的测定，所需研究内容如下：1、 校正因子f：在这里定义为某杂质R与所选定的基准物质S的绝对定量校正因子（即单位峰面积所代表的物质的量）之比。即相对校正因子（f）= ，W为重量，故这里的相对校正因子也称为相对重量校正因子，通常简称为校正因子。公式中带入浓度来表示，则校正因子f As 待测组分的峰面积（有时也用峰高）；AR 杂质对照品的峰面积； cS 待测组分的浓度； cR 杂质对照品的浓度。实际操作：精密称（量

16、）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制成一定浓度的混合溶液（杂质对照品浓度应与所控限度相符，待测成分对照品应与所用自身对照溶液浓度相符），记录色谱图，按上述公式进行校正因子的计算。要求：分别配制3份溶液，求f平均值，RSD值不大于2.0%。2、相对响应因子F：国外药典习惯用相对响应因子法来计算，与中国药典上所说的校正因子f互为倒数关系，在这里定义为某杂质R与所选定的基准物质S，单位量下在检测器中产生的响应值之比（一般以峰面积或峰高计）。F = ，各符号含义、操作要求同上。3、供试品测定取供试品溶液和自身对照溶液，分别进样，测量供试品溶液色谱图上杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子（或者除以

17、相应的响应因子）后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。3.2 溶出度参考上海药检所谢沐风老师的关于溶出度研究的一系列文献进行研究。溶出度研究试验主要包括以下内容：（1）溶出介质的选择，（2） 溶出介质体积的选择，（3）溶出方法（转篮法与桨法）的选择，（4）转速的选择，（5）溶出度测定方法的验证，（6） 溶出度均一性试验（批内），（7）重现性试验（批间）等。下面详细介绍试验内容。3.2.1 溶出介质的选择：建议采用多条溶出曲线对产品的内在品质进行评价。选取原则建议如下： 【普通制剂】 (1) 酸性药物制剂 pH值分别为1.0或1.2、5.56.5、6.87.5和水； (2) 中性或

18、碱性药物/包衣制剂 pH值分别为1.0或1.2、3.05.0、6.8和水； (3) 难溶性药物制剂 pH值分别为1.0或1.2、4.04.5、6.8和水； (4) 肠溶制剂 pH值分别为1.0或1.2、6.0、6.8和水； 【调释制剂】 pH值分别为1.0或1.2、3.05.0、6.87.5和水。3.2.2 溶出介质体积的选择：需满足漏槽条件（溶出介质体积应大于药物全部溶解所需体积的3倍）。一般一个剂量单位以溶剂900ml或1000ml为最普遍，规格较小时也可使用常用体积的1/23/4。小杯法常用体积为100250ml。 3.2.3 溶出方法的选择：一般情况下，片剂多选择桨法，转篮法多用于胶囊

19、剂或漂浮的制剂，某些特殊制剂选用小杯法。3.2.4 转速的选择：转篮法以100转/分为主；桨法以50转/分为主。一般认为桨法50转/分相当于转篮法100转/分。转速的设置与具体品种有关，通常，药物制剂的溶出速度随着转速的增加而增大。转速过快，可能会导致对不同制剂溶出行为的区分能力差，所以不推荐选择过高转速。转速的选择应以能区分不同处方和生产工艺的产品为宜， 如确实需要选择高转速，应进行充分的验证。3.2.5 溶出度测定方法的验证：方法学验证内容与含量测定基本相同，应进行专属性试验（辅料、胶囊壳的干扰试验）、线性试验、回收率试验、溶液稳定性试验等。应该注意的是，在方法学验证中，试验所用的溶媒应为

20、溶出介质，即应考查辅料、胶囊壳在溶出介质中的干扰，药物在溶出介质中的线性、回收率及稳定性等。3.2.6 取样点和限度的确定：通过溶出度均一性试验（ 考察同一批样品的溶出曲线）和重现性试验（ 考察至少3批样品的溶出曲线），确定合理的溶出度测定取样点和限度。为避免多次取样造成的误差，测定溶出曲线时取样点不宜过多，通常为56个点，小规格的制剂因采用100250 ml溶出介质，所以溶出曲线一般可选34个时间点。限度应综合考虑溶出曲线拐点和一般性要求。胶囊壳的干扰试验经常被忽视。参照中国药典2010年版二部附录X C溶出度测定法：如胶囊壳对分析有干扰，应取不少于6粒胶囊，尽可能完全的除尽内容物，置同一个

21、溶出杯内，按该品种项下规定的分析方法测定每个空胶囊的空白值，作必要的校正。如校正值大于标示量的25%，试验无效。如校正值不大于标示量的2%，可忽略不计。实际操作方法可进行改进，先取空白辅料适量（含囊壳），配制成空白溶液，依法测定，若干扰小于2%，可忽略；若干扰25%，可考虑在限度上适当提高，超过5%以上则测定方法不可取，应重新选择溶出度测定方法。在溶出度研究资料中，另一个被忽视的问题是滤膜吸附情况的考察（滤膜孔径不大于0.8m）。在溶出度研究时，一定要考察试验所用滤膜对主成分是否有吸附， 中国药典溶出度测定法对微孔滤膜的规定为“滤孔应不大于0.8m，并使用惰性材料制成的滤器，以免吸附活性成分或

22、干扰分析测定”。工作中常用滤膜有水系和有机系两种，滤膜孔径0.45m、0.80m。判定吸附与否的方法可采用：(1)取溶出液过滤，舍去不同体积的初滤液后测定，观察响应值的变化，了解被测药物与滤膜的吸附情况。(2)取样后，一部分不过滤，直接采用高速离心，取上清液测定。另一部分采用过滤法，取所得的续滤液测定，考察两者间测定数据的差异。(3)取对照品溶液，经滤膜过滤后，与原溶液进行比较，观察测定前后数据的变化。一般认为吸附量在2.0%以下时可忽略不计，超过2.0%建议或在质量标准中明确注明滤膜规格或滤膜预处理方法（如煮沸1.5 h）、增加初滤液量（常规为5ml）或规定样品高速离心后取上清液测定。另外在

23、溶出度研究中还应注意溶出度试验仪的校正、溶出介质的脱气等，保证实验数据的准确性，以全面正确和客观地反映药物的溶出情况。几点说明：（1）溶出度测定的方法学验证：记住所用溶媒应为溶出介质。如果是紫外法测定，供试品溶液吸光度在0.30.7之间，线性范围可作至0.20.8之间。回收率试验一般按供试品溶液浓度的50%、限度和100%配制。（2）根据实际需要，可在溶出介质中添加表面活性剂，但应对添加剂种类与浓度进行评价。浓度研究应从0.01%（w/v）起点、按照1、2、5级别逐步增加，不建议采用3.0%以上的浓度。禁止使用有机溶剂！当体内生物利用度优良，必须放宽体外溶出度试验参数时，可通过加大表面活性剂浓

24、度的方式得以实现（表面活性剂的配制，用煮沸法）。（3）难溶性药物，如难以采用溶出介质直接溶解对照品，可先加少量有机溶剂（如甲醇或乙醇）溶解后，再加溶出介质稀释的办法，建议最终溶液中有机相比例不超过2%。（4）试验前先进行原料药在各pH值溶出介质中的稳定性考察（建议先测原料药在不同介质中的溶解度），以确保试验数据的准确测定。（5）溶出均一性试验：考察同一批样品的溶出曲线（1批，6片，每片画一条曲线，共6条曲线）。（6）溶出重现性试验：考察至少3批样品的溶出曲线（3批，每批6片，6片同一取样点取平均值，不同取样点画一条曲线，共3条曲线）（7）溶出曲线相似性的判定：相似因子法f2（详见谢沐风撰写的文

25、献资料）。4 含量测定介绍一下HPLC法含量测定试验及方法学可接受的标准。4.1 色谱条件的确定与系统适用性试验如果和有关物质检查色谱条件一致，则注明“色谱条件同有关物质项下相应内容”；如果色谱条件不一致，则同有关物质检查一样作流动相筛选等试验。4.2 线性试验取对照品适量，先配制一高浓度储备液，然后稀释至一定浓度（比如：设计为取1、3、5、8、10ml至某量瓶，中间浓度为100%供试品浓度），以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，按最小二乘法进行线性回归。可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.999，Y轴截距应在100%响应值的2.0%以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。标

26、准曲线附在本项试验内容中。4.3 进样精密度试验进样精密度应属高效液相色谱法中的系统适用性项下的要求见药典附录V D ，2.（3）重复性，原文要求如下：用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0%。我们的做法：外标法，一般可取“线性试验”项下中间浓度的对照品溶液或单配一个对照品溶液或供试品溶液，连续进样5

27、次，求峰面积A的RSD值；内标法，按上述要求计算平均校正因子。可接受的标准为：RSD2.0%。4.4 溶液稳定性试验如果色谱条件同有关物质，则含量的溶液稳定性试验可不作，溶液稳定性同有关物质溶液稳定性结论。如果色谱条件同有关物质不一样，则取供试品在0、2、4、6、8h进样，求主峰面积的RSD值；如果不稳定，作2h内溶液稳定性（常温或低温）。可接受的标准为：RSD2.0%。溶液不稳定的，须注明“临用新制”。4.5 回收率试验按供试品浓度的80%、100%和120%称取对照品适量（每个浓度作3份），按处方量100%加入辅料，按拟定的含量测定方法测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%102.0%之间，9个回收率数据的RSD2.0%。另：可以用原料药代替对照品，但前提是必须先对原料药进行标定。4.6 重复性试验配制6份相同浓度的供试品溶液，按拟定的含量测定方法进行含量测定。可接受的标准为：6份样品含量的RSD2.0%。4.7 中间精密度试验配制6份相同浓度的供试品溶液，由不同分析人员、在不同时间、用不同仪器进行含量测定。可接受的标准为：与重复性