分子系统学和分子鉴定

1、关于分子系统学与分子鉴定第一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月内容什么是分子系统学什么是系统发育树建树方法如何建树第二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月分类学与系统学分类学通常被分为分类学( taxonomy)和分类学( taxonomy)等不同阶段。分类学:对于多样性的生物进行分类、描述，按照各类群生物的国际统一命名法规进行不同等级和类群的命名 分类学:通常也被称之为系统学，即将生物的分类群或分类单位按照生物演化顺序排列成一定的系统系统学是研究各等级、各类群之间的演化关系，按照生物演化顺序将它们排列成一定的“系统” (英文system，拉丁文systema)。第三张，PPT共

2、六十七页，创作于2022年6月系统发育树A tree is a mathematical structure which represents a model of an actual evolutionary history of a group of sequences or organismsIn other words, it is an evolutionary hypothesis第四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Phylogenetic trees第五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 Topology of A TreeA tree consists of

3、nodes connected by branchesOne unique internal node is the root of the tree: the ancestor of all the sequencesInternal nodes represent hypothetical ancestorsTerminal nodes represent sequences or organisms for which we have data. Each is typically called a “Operational Taxonomical Unit” or OTU.第六张，PP

4、T共六十七页，创作于2022年6月 Related TermsThe ingroup is the group actually studied by the investigator. That is, it is the group of interest.第七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月A sister group is the taxon that is genealogically most closely related to the ingroup. The ancestor of the group cannot be its sister because the

5、 ancestor is a member of the group. Related Terms第八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月An outgroup is any group used in an analysis that is not included in the taxon under study. It is used for comparative purposes, usually in arguments concerning the relative polarity of a pair (or series) of homologous character

6、s. The most important outgroup is the sister group, and considerable phylogenetic research may be needed to find the sister group. Usually more than one outgroup is needed in an analysis. Related Terms第九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 Related Terms第十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月目前用蛋白质和核酸序列进行系统发育关系分析的方法有：距离法（Distance

7、Methods）其中邻接法（Neighbor Joining, NJ）最受欢迎最大简约法（Maximum Parsimony, MP）最大似然法（Maximum Likelihood, ML）Bayesian法Methods for Constructing Phylogenies第十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月用最大简约原则（Maximum Parsimony, MP）来推断最好的系统树理论依据：解释一个过程的最好假说应是假设条件最少的假说。因此，对于分子数据（DNA序列数据），该方法计算在最少的碱基替换条件下能够解释整个进化过程的拓扑结构（系统进化树）。简约原则在逻辑上的要

8、求是在多种解释中选取最简单的。在分析系统发育关系时，最简约的树是对数据集进化途径最短的解释（即从祖先分类单元到现生单元性状变化的数目最少）Methods for Constructing Phylogenies第十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月The steps involved in creating a phylogenetic tree from molecular data are:Identify a protein or DNA sequence of interestIdentify other sequences that are related to the s

9、equence of interest and obtain electronic files of those sequencesAlign the sequencesUsing the results of alignment , generate a phylogenetic treePrint (and perhaps publish) the resultsHow to Create a Tree?第十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 获取相关基因序列数据Download from GenBankSequenced by investigator第十四张，PPT共六十七页

10、，创作于2022年6月输入/网址 Eurytomidae 28S ribosomal RNA gene 第十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月自行扩增后获得的新序列从研究的样本直接提取DNA，扩增测序，得到序列文件用Sequencher（版本3.1.1）、SeqScape或BioEdit软件对测得的序列进行校对和编辑，确保序列的准确性保存成FASTA或纯文本格式。获取相关基因序列数据第十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月创建输入文件

11、 由GenBank下载的序列创建运行MacClade软件，在“File”菜单中选择“New File”命令在“Taxa”下拉菜单“Improt Sequences”选择子菜单“FASTA File”打开下载的序列文件batchseq.cgi将输入的矩阵保存成NBRF格式（File下拉菜单中的子菜单“Export File”中的“NBRF”选项）第二十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月创建输入文件由自行扩增的序列创建运行MacClade软件，在“Taxa”下拉菜单“Import Sequences”选择“File with Only Sequence”命令；然后逐条地输入目的序列；将输入

12、的矩阵保存成NBRF格式（File下拉菜单中的子菜单“Export File”中的“NBRF”选项）。第二十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月创建输入文件第二十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Positional homolog (点同源)序列数据首先必需进行比对,以便能够对同源位点（比较的单位）进行比较和分析目前应用得最多的关于序列排序的软件是Clustal X 1.81 序列的比对（Alignment） 第二十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月利用Clustal X软件进行序列比对 用Clustal X软件打开以上保存的NBRF格式的文件，进行多序列的比对（

13、Multiple alignment）。在“Alignment”菜单的下拉菜单“Alingment Parameters”中选择“Multiple Alignment Parameter”进行多序列比对的参数设置。参数设置是Gap Opening = 10，Gap Extension = 0.2第二十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月利用Clustal X软件进行序列比对 第二十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月在“Alignment”下拉菜单“Output Format Options”中选中“NEXUS format”选项；然后做“Do Complete Alignme

14、nt”比对后，用MacClade 4.0软件打开排序后产生的“.nxs”文件。手工校对排序的结果，并删除那些难以比对的高变区（hypervariable regions）Swofford等(1996)认为排除这些区域，可以提高系统发育关系结果的可靠性。利用Clustal X软件进行序列比对第二十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月系统发育关系分析调用目的文件：运行PAUP软件；在“File”下拉菜单中选择“Open”命令，找到从Clustal X排序后产生的“.nxs”文件；点击“Execute”命令排除非信息位点：选中“Data”下拉菜单中的“Include-Exclude Char

15、acters”选项，排除“uninf”位点选择分析原则及搜索最佳树的参数设置：在“Analysis”菜单中选中“Parsimony”；然后进行“Heuristic”搜索；其参数设置是：General Search Options = Best trees only Starting trees for branch-swapping = Get by stepwiseStepwise-Additon Options = random, # reps = 1000Swapping algorithm = TBR第二十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月系统发育关系分析第二十八张，PPT共

16、六十七页，创作于2022年6月合意树：在“Trees”菜单中，点击“Compute Consensus”，选中“Strict”，点击“OK”，获取严格的合意树。系统发育关系分析第二十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第三十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 系统发育关系分析赋根：在“Options”的下拉菜单中选中“Rooting”，为树赋根；有两种方案，是Outgroup rooting；是Midpoint rooting第三十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月系统发育关系分析输出树：在“Trees”下拉菜单中选择“Print trees”以打印树。参数设置如下：

17、Plot type = Rectangular CladogramLine width = 1.5Font = HelveticaSize = 14Styles = Bold & Italic。 第三十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月评价结果的可靠性在得到树（或树集）后，必需做的是评价结果的可靠性。主要有Bootstrapping方法。Bootstrapping（Felsenstein ，1985）用于评价系统树各节点的支持率，通常支持率在90以上是最可信的。在测试中共重复1000次。第三十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月选中Bootstrap；Number of re

18、plicates = 1000Type of search = Full heuristicConsensus tree options = Retain groups with frequency 50% 评价结果的可靠性第三十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月评价结果的可靠性点击Continue；在Heuristic Search的Stepwise-Addition Options中的random的# reps的值改为1000；点击Search运算结束后，点击Trees下拉菜单中的Print Bootstrap Consensus以打印结果第三十五张，PPT共六十七页，创作于20

19、22年6月Parsimony Tree based on ITS sequenceT. songshanenseT. songshanenseT. taiyuanenseT. songshanense第三十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Softwares 第三十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月红火蚁（Solenopsis invicta）分子检测技术研究 中国检验检疫科学研究院第三十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景研究目的材料和方法结果分析与讨论第三十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景分类地位膜翅目（Hymenoptera）蚁科（

20、Formicidae）家蚁亚科（Myrmicinae）火蚁属（Solenopsis） 第四十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景分布国外：巴西、阿根廷、安提瓜和巴布达、特立尼和多巴哥、波多黎各、巴哈马群岛、特克斯和凯科斯群岛、英属维尔京群岛、美属维京群岛、美国、澳大利亚、新西兰、马来西亚国内：中国台湾省、香港、澳门和广东省吴川等第四十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月预测分布图第四十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月中国预测分布图第四十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景形态方面单家蚁属（Monomorium）、大头家蚁属（Pheidole）、

21、拟大头家蚁属（Pheidologeton） 、热带火蚁（Solenopsis invicta）黑火蚁 S. richteri 相似。尤其是幼虫和卵更难区分。分子方面红火蚁 Solenopsis invicta，黑火蚁 S. richteri，热带火蚁 S. geminata和 S. quinquecuspis 四个种 第四十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景 危害经济危害农作物，电力设备等社会人类健康生态环境降低生物多样性第四十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究目的红火蚁的分子检测技术研究筛选引物与探针，建立红火蚁不同虫态卵、幼虫、成虫快速、准确的实时荧光PCR

22、分子检测体系，为口岸快速查验和大通关提供有力的技术支持。 第四十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月材料与方法确定红火蚁主要分布的地区及要采样的地点；获取红火蚁不同地理种群标本；筛选并优化红火蚁分子检测探针。第四十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月技术 路 线第四十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月国内标本收集标本国外标本序列比对基因测序DNA提取扩增构建红火蚁分子检测技术体系筛选分子检测引物与探针GenBank第四十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月材料与方法样品 总共选取红火蚁5个种群和热带火蚁1个种群为研究对象。只选取采自同一地点，至少有两个个体(卵

23、、幼虫、成虫)的同种标本提取基因组DNA。其中一头标本用于分子生物学实验，其余的作为形态鉴定参考(voucher species) 。第五十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月标本号种 类采集地1Solenopsis invicta深圳公明广记花场2Solenopsis invicta深圳光明农场3Solenopsis invicta珠海斗门白蕉镇4Solenopsis invicta珠海回归公园5Solenopsis geminata广西北海6Solenopsis invicta广东吴川第五十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月材料与方法提取基因组DNA采用Wizard方法（P

24、romega）提取基因组DNA，可成功提取卵、幼虫、成虫单个个体的基因组DNA。标本最初保存在浓度为100的酒精中；随后转至70的酒精中长期保存。第五十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月材料与方法设计引物与探针GenBank发表火蚁属（Solenopsis）的COI基因序列有102条，分别属于Solenopsis invicta, S. richteri，S. geminata和 S. quinquecuspis四种，标本来源分别为阿根廷、巴西和美国。用Clustal X软件对COI基因序列进行比对后，分析保守区与高变区，针对红火蚁的特异序列，手工设计了引物与探针。 第五十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月材料与方法序列的比对（alignment）与分析比对（Clustal X, Thompson et al., 1997)Neighbor-Joining Tree Thinking第五十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第五十五