常规石蜡制片染色技术

1、关于常规石蜡制片染色技术第一张，PPT共八十九页，创作于2022年6月光镜标本的基本制作技术第二章第二张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 光镜样本的基本制作技术（组织制片技术）是医学研究和生物学研究中，观察细胞、组织的正常或病理形态变化的一种必不可少的手段，借此可以弥补活体观察的不足 同时光镜样本的基本制作技术也是其它光镜标本技术的基础第三张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 取材 固定 漂洗 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 脱蜡 染色 脱水 透明 封片光镜样本的制作的基本过程第四张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第一节 取材及固定医学研究的组织样本来源 人体（最好） 临床

2、的活检组织 尸检组织 （取材方法及注意事项按病理学要求进行） 正常组织 用正常动物的组织材料替代第五张，PPT共八十九页，创作于2022年6月一、动物致死法 动物的福利，3R原则 动物致死法选择 致死动作应迅速第六张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第七张，PPT共八十九页，创作于2022年6月1断头法 2击头法 3麻醉法4股动脉放血法 5空气栓塞法动物致死方法第八张，PPT共八十九页，创作于2022年6月细胞标本制备 1. 印片法 2. 穿刺法 3. 沉淀法 4. 培养细胞标本制备第九张，PPT共八十九页，创作于2022年6月二、取材及注意事项1材料保持新鲜2组织块免受挤压3组织块力求

3、小而薄 4尽量保持组织的原有形态5选取好组织块的切面 6动物品种的选择和熟悉取材的解剖位置7切除不需要的部分8保持材料的清洁第十张，PPT共八十九页，创作于2022年6月三、组织固定法 固定是使要观察的组织构造尽量接近它取材前的状态第十一张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（一）固定目的 1标本不发生离开身体后或死后变化 2随后处理中，标本不易损坏 3. 组织块硬化 4使组织内各种结构产生不同的折光 率，或对染料具有不同的亲和力第十二张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 （二）固定方法 1蒸气固定法（较细小而薄的标本） 2小块组织固定法（直接投入固定液中） 3注射、灌注固定法（体积

4、过大或固定 液极难渗入内部的组织标本） （1）局部灌注固定（肺、肝、肾、脑等） （2）全身灌注固定 （小鼠、大鼠、兔、 狗、猴、人） 4. 微波固定法 第十三张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第十四张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 灌注过程 充分暴露心脏 针尖插入左心室或升主动脉中 快速灌注生理盐水 剪开右心耳（或右心房）放血 换灌固定液，先快后慢输入第十五张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 用量 1. 生理盐水 大鼠需用80-100ml、兔150-200ml、 猫200-250ml、猴300-500ml、 狗800-1000ml 2. 固定液 动物血液量的2倍 动物

5、体重（g）7%20（ml）第十六张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 无论是局部灌注固定，还是全身灌注固定，在灌注完毕后，必须立即将组织块、器官或整个动物再放入同样的固定液中进行后固定第十七张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 1组织块不宜过大 2软组织或较大块组织可先经23小时固定后，再修整成小块重投入新配制的固定液内继续固定 3固定液的量是组织块大小的5-20倍为宜，在固定组织的瓶底垫上脱脂棉、数层纱布或滤纸 4固定时间的长短视固定剂的种类、温度、组织块的大小而定（三）固定注意事项及影响因素第十八张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 1甲醛（福尔马林）：商品甲醛的浓度是3

6、7% 40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液浓度是10%，而实际甲醛浓度只有4% 固定小块组织(15152mm)10小时左右 经它长期固定的组织，需经2448小时的自来水流水冲洗四、固定液 （一）单纯固定液第十九张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 甲醛单纯固定液的常用配方 10%甲醛水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 自来水或蒸馏水 90ml 10%甲醛生理盐水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 氯化钠 0. 85g 自来水或蒸馏水 90ml第二十张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 2多聚甲醛：一种渗透速度极快的甲醛聚合物，在热水中可解聚成甲醛单体而溶解，在接近水的沸点时溶

7、解极快；也可溶解于弱碱中。多聚甲醛溶液实际上是新配制的甲醛液，宜临用前配制第二十一张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 4%多聚甲醛单纯固定液的常用配方 多聚甲醛 4g 蒸馏水（或0.2 mol/L PB） 50ml 在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却 0.2 mol/L PB（或蒸馏水） 100ml 第二十二张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 3戊二醛：一种常用的醛类固定剂，能较好的保存组织结构，但其穿透力弱，作为单纯固定液多用于电镜技术中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用时需配制成1%6%的不同浓度第二十三张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 4酒精：单纯固定液为80

8、%95%的浓度，不必水洗而直接脱水。多用于组织化学中的糖原固定 酒精固定的组织易变硬和发脆、组织收缩较大，所以不易长时间停留其中（70%酒精除外） 可作为配制混合固定液的基本成分第二十四张，PPT共八十九页，创作于2022年6月5 其它固定液 丙酮 苦味酸 醋酸 重铬酸钾 三氯醋酸 铬酸 氯化汞 锇酸第二十五张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 用多种具有固定作用的试剂混合配制的固定液，达到各试剂在固定作用中具有的优缺点平衡目的（二）混合固定液第二十六张，PPT共八十九页，创作于2022年6月常用混合固定液1酒精-甲醛液（A-F 液） 95%或无水酒精（A） 90ml 37%40%甲醛液

9、（F） 10ml 2Carnoy液 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml 无水酒精 60ml3Bouin 液 饱和苦味酸水溶液 75ml 甲醛液（37%40%） 25ml 冰醋酸 5ml第二十七张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 4Helly 液 重铬酸钾 2.5g 升汞 5g 蒸馏水 100ml （以上是Helly储存液） 甲醛液(37%40%) (临用时加入) 5ml 51%多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液 多聚甲醛 1g 蒸馏水 50ml 在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却 25%戊二醛 5ml 0.2 mol/L PB（pH 7.4） 100ml第二十八张，PPT共八十九页，创作

10、于2022年6月第二节 固定后处理及切片一、组织修整 固定结束后，将受挤压或不需要的部分组织修切或整形，同时选择好包埋面，称组织修整。修整可在冲洗前、也可放在冲洗后第二十九张，PPT共八十九页，创作于2022年6月二、组织洗涤 洗去渗入组织内的固定液，再进行下一步骤的操作；否则会妨碍染色效果，或引起沉淀、结晶而影响观察，也可能会继续发生化学反应造成后道操作困难 1水洗涤法：凡用水配制、或含铬、锇等的固定液所固定的组织块，需用水洗涤 2酒精洗涤法：凡用酒精、或酒精混合液、或含有苦味酸等固定液固定的组织块，多采用酒精洗涤第三十张，PPT共八十九页，创作于2022年6月三、组织脱水（一）脱水意义与脱

11、水剂 因水和石蜡不能相溶，而组织经固定及水洗后含有水分，所以不能直接用石蜡进行包埋。需用某些溶剂逐步置换组织块中的水分，称脱水 脱水剂必须具有下列特性：1）脱水剂能与水按任意比例混合；2）脱水剂高浓度时不含水分；3）脱水剂也能与透明剂按任意比例互相混合第三十一张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 脱水剂中最常用的是酒精。 一般从70%酒精开始脱水，逐步升高酒精浓度；脱水时间根据组织块的种类、大小、及使用的固定液种类等因素而定第三十二张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 70%酒精 25小时(可长期保存组织) 80%酒精 25小时 90%酒精 25小时 95%酒精（） 25小时 95

12、%酒精（） 25小时 无水酒精（） 30分钟 无水酒精（） 30分钟 无水酒精（） 30分钟 （二）脱水步骤和时间 以18mm18mm，厚约23mm的组织块 为例，其脱水步骤和参考时间如下第三十三张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（三）脱水注意事项 1组织脱水必须掌握由低浓度逐步 过渡到高浓度的原则 2脱水时间要适度 3组织脱水要彻底干净第三十四张，PPT共八十九页，创作于2022年6月四、透明（一）透明意义及透明剂 组织脱水后，内部仅含脱水剂，但大多数脱水剂不能与石蜡相溶，石蜡仍不能浸入组织内进行包埋和切片。为此，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于包埋剂（石蜡）的溶剂，以便逐步将脱水剂置

13、换成包埋剂。这一过程往往使组织呈半透明状，故称透明 二甲苯为石蜡包埋法中最常用的透明剂；它透明能力强，但易使组织收缩、变脆，故组织块的透明时间不宜太长，小组织块以30分钟为宜，较大组织块适当延长但不超过2小时第三十五张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（二）透明步骤和时间 为了减少组织块过度收缩，往往在无水酒精之后，先经过酒精和二甲苯的混合液，然后再浸入纯二甲苯中 透明步骤和时间大致如下 1无水酒精:二甲苯=1:1 2030分钟 2二甲苯（） 2030分钟 3二甲苯（） 2030分钟第三十六张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（三）透明注意事项 二甲苯必须保持无水 组织块脱水过程要

14、彻底第三十七张，PPT共八十九页，创作于2022年6月五、浸蜡（一）浸蜡目的 浸蜡是将透明过的组织块在熔化的石蜡中浸渍的过程。目的是用石蜡代替组织块中的二甲苯，在随后温度下降中，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块，以便切片机切片第三十八张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 第1杯熔蜡(软蜡)(熔点54以下) 1小时 第2杯熔蜡(硬蜡)(5860) 1小时 第3杯熔蜡(硬蜡)(5860) 30分钟 整个浸蜡时间控制在3小时之内 浸蜡在恒温箱中进行，且恒温箱温度高 于石蜡熔点 23（二）浸蜡的步骤第三十九张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（三）浸蜡注意事项 1浸蜡最佳温度应是石蜡

15、刚熔化、或蜡杯底部 尚残留小部分未熔完蜡时的温度 2浸蜡中一般采用浸蜡篮浸蜡法，把组织块和 标签一齐装入分格篮内浸蜡 3石蜡应在加热的条件下过滤除去杂质 4浸蜡用的石蜡要定期更换 5新石蜡应在使用前放在温箱内熔化一次，使 其中的挥发性物质蒸发 6包埋结束后应将熔蜡从温箱内取出，以免 石蜡无益地加温熔化第四十张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第四十一张，PPT共八十九页，创作于2022年6月六、包埋（石蜡包埋法）（一）包埋目的及包埋剂 包埋是将某些特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物质的物理特性，将整个组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的较硬固态结构，以便切片机制备极薄切片 石蜡是组

16、织学切片技术中最常用的包埋剂第四十二张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（二）包埋过程 1取预热包埋框及金属板，搭成包埋模具 2. 迅速倾注少量熔蜡于包埋框中 3. 从蜡杯中夹取组织块，切面向下置于框底 4. 加熔蜡至包埋框上缘 ，将标签纸紧贴旁边 5. 表面熔蜡凝结至一定厚度时，慢慢浸入冷水 中（夏天用冰水）急速凝固 6. 凝结蜡块自动漂浮于水面，或30分钟后推开 包埋框，取出蜡块。 7. 修块第四十三张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第四十四张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（三）包埋注意事项 1包埋蜡的熔点选择 2石蜡脆性大时，可加蜂蜡提高韧性 3包埋用石蜡和最后浸

17、蜡的石蜡熔点要 相同 4包埋中组织块间要有一定距离 5石蜡凝固要快速第四十五张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第四十六张，PPT共八十九页，创作于2022年6月七、切片（一）石蜡切片机及切片刀 1石蜡切片机 最常用的石蜡切片机是轮转式切片机，它的切片刀固定不动，而靠右侧旋转的重轮带动螺纹轴和齿轮，将组织块夹具按所调节的切片厚度向前推进，并在上下平面运动，让组织块经过前下方切片刀而切成一定厚度的切片第四十七张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第四十八张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 2切片刀与磨刀 石蜡切片常用的切片刀为平楔型切片刀，也有一次性切片刀 非一次性使用的切片刀

18、在切片前需要研磨，以保持其锋利；研磨刀可分为手工研磨刀和机械研磨刀（磨刀机）两种第四十九张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第五十张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第五十一张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第五十二张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（二）石蜡切片过程 1修块 2蜡块和切片刀固定 3调整蜡块切面和切片刀角度(10以内) 4. 调整刀台与标本台距离 5. 修整蜡块切面，暴露完整组织切面 6. 调整切片厚度调节器(厚度为68m) 7. 正式切片 8切片展平 9贴片和烘片第五十三张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第五十四张，PPT共八十九页，创作于

19、2022年6月第五十五张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第五十六张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 （1）切片碎卷状：脱水、透明或浸蜡时间长、浸蜡温度高 （2）蜡片卷曲：刀口不锋利或脏、刀角倾斜过度、石蜡过硬 （3）切片不成蜡带：室温低、石蜡过硬、蜡块上下边过小或 不平 （4）蜡带弯曲：蜡块的两侧大小不等、刀口不锋利 （5）切片皱褶：石蜡过软、浸蜡不完全、刀的倾斜角度过小 （6）切片厚薄不均：刀口不锋利、切片机性能不佳、刀架或 刀或蜡块未固定牢 （7）切片出现纵纹：刀刃有缺口、石蜡或组织的硬度不一 （8）切片出现横纹：蜡块、刀或刀架未固定好 （9）切片粘刀：刀锋沾污、刀的倾斜角

20、度过小、刀口不锋利 （10）蜡块底边呈白色：刀的倾斜角度过小 （11）切片粘蜡块：刀纯、刀口不洁、室内温度高、太干燥（三）切片过程中常遇问题及可能造成原因第五十七张，PPT共八十九页，创作于2022年6月第三节 苏木素-伊红染色方法 染色是将组织浸入染料配制的染色液中，使组织中的不同结构染上不同颜色或不同深浅的颜色，从而产生不同的折射率，便于在光镜下清楚地显示组织内部各种构造 第五十八张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 染料是一类有色的以苯环为基础的有机化合物，它不同于一般颜料，因为它不但有颜色，更重要的是它对组织的不同成份具有不同的亲和力。构成染料至少必须有两种原子团连接于苯环上，即

21、能使染料显色的原子团-发色团和能使染料对不同组织具有不同亲和力及加深颜色的原子团（酸、碱性基团）-助色团第五十九张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 分类 细胞核染料有天然染料苏木素、胭脂红及人工合成的染料结晶紫、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、焦油紫等 细胞质染料有人工合成的伊红Y、酸性复红、苦味酸、水溶性苯胺蓝等第六十张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 媒染剂为有些二价或三价金属物质，如铝、铁、铜、钨等可作为中介媒体物质，使原来几乎不与组织结合或结合能力很弱的部分染料（尤其是天然染料）着色；它主要是通过增加染料对组织中某一成份的亲和能力，自身又与染料或组织发生结合而发挥作用第六十一张

22、，PPT共八十九页，创作于2022年6月 助染剂（促染剂）与媒染剂不同，它只加强染 料的染色能力，而自身不参与染色反应 分化剂（脱色剂、分色剂）用于退行性染色 法中脱去组织过染的染料，降低着色颜色 酸性分化剂 0.51%的盐酸酒精（95%以 下）或较稀的冰醋酸水溶液 氧化分化剂 苦味酸、铬酸、重铬酸钾、 过锰酸钾等 媒染分化剂 既能促使组织和染料结合， 又可使已经结合到组织上的染料脱离第六十二张，PPT共八十九页，创作于2022年6月一、苏木素-伊红染色的基本原理 苏木素和伊红染色是组织学中常规制片中最基本，也是应用最广泛的染色方法，故称常规染色（简称HE染色） 第六十三张，PPT共八十九页，

23、创作于2022年6月 苏木素（或苏木精）是一种天然的染料，易溶于酒精而微溶于水，是较好的细胞核碱性染料，并可将细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色；苏木素分子须经氧化形成苏木红分子，才具有真正的染色能力；同时须配合适当的媒染剂以增强它对组织的亲和力，达到染色目的 伊红（或曙红）是人工合成的煤焦油类染料，红色粉末状，易溶于水或酒精，为酸性细胞胞质染料；有伊红Y、B、BN等，常用的是伊红Y。伊红常作为苏木素的对比染色染料，染色中常需加助染剂和分化剂，使染色效果更加好 第六十四张，PPT共八十九页，创作于2022年6月二、苏木素-伊红染液的配制（一）苏木素染液 一种是将氧化剂（如氧化汞、高锰酸钾、过

24、氧化氢或碘酸钠等）与媒染剂（硫酸铝铵、硫酸铝钾或硫酸铝铁等）直接混合于苏木素中配成溶液 另一种是先用媒染剂媒染组织结构，再用氧化的苏木素（自然氧化）染色，最后用媒染剂分色 第六十五张，PPT共八十九页，创作于2022年6月Harris苏木素染液 苏木素 1g 无水酒精 10ml 硫酸铝钾（或硫酸铝铵） 20g 蒸馏水 200ml 氧化汞 0.5g第六十六张，PPT共八十九页，创作于2022年6月Mayer苏木素液 苏木素 1g 蒸馏水 1000ml 碘酸钠 0.2g 硫酸铝钾 50g 枸橼酸钠 1g 水合氯醛 50g第六十七张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 醇溶性伊红染液 伊红Y 0

25、.5g 95%酒精 100ml 水溶性伊红染液 伊红Y 0.5-1g 蒸馏水 75ml 95%酒精 25ml 冰醋酸 12滴 （二）伊红染液第六十八张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（三）分化液 去除过度染色或不需要着色的组织成份上颜色的过程，叫分色所使用的试剂配制的液体称为分化液而苏木素的分化过程中，使酸性条件转变成碱性条件，苏木素染色的结构也由红色转变成蓝色，所以这一过程又称蓝化 第六十九张，PPT共八十九页，创作于2022年6月 1氢氧化铵水溶液（pH 7.5-8.0 ） 氢氧化铵（氨水） 3ml 蒸馏水 1000ml 21%盐酸酒精溶液 盐酸 1ml 70%酒精 99ml第七十

26、张，PPT共八十九页，创作于2022年6月三、石蜡切片染色中脱蜡、水洗、 脱水和透明等的作用 石蜡 去石蜡 去二甲苯 水化 颜色 二甲苯 酒精 水 染液 透明 脱水 水分 二甲苯 酒精第七十一张，PPT共八十九页，创作于2022年6月四、染色程序 （一）脱蜡至水 石蜡切片 冰冻切片 1二甲苯（） 5分钟 2二甲苯（） 5分钟 3无水酒精（） 5分钟 4无水酒精（） 5分钟 595%酒精 5分钟 680%酒精 1分钟 770%酒精 1分钟 8自来水 2分钟 3分钟 9蒸馏水 1分钟 1分钟第七十二张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（二）染色 石蜡切片 冰冻切片 1苏木素液 5-15分钟 1-2分钟 2自来水洗 1分钟 30秒 3酸性分化液（镜下控制） 30秒 20秒 4自来水蓝化 20分钟 20秒 5稀氨水 30秒 6. 蒸馏水 10秒 20秒 770%酒精 3分钟 3分钟 880%酒精 3分钟 3分钟 9沉淀酸化伊红乙醇液 30秒 30秒第七十三张，PPT共八十九页，创作于2022年6月（三）脱水、透明和封片 石蜡切片 冰冻切片 195%酒精（） 1分钟 1分钟 295%酒精（） 1分钟 1分钟 3无水酒精（） 5分钟 3分